THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mix

THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mixは、従来品のTHUNDERBIRD^® qPCR Mix の組成を大幅に改良した製品です。PCR効率を上げ、非特異反応(プライマーダイマー等の発生)を抑えることで、幅広い定量可能域(ダイナミックレンジ)を得ることができます。

2×濃度のプレミックス試薬になっており、プライマー以外の成分があらかじめ混合されています。また、リアルタイムPCR反応やシグナルには影響のない、青色の色素で着色されており、ピペッティングの際に試薬が見やすいため、分注ミスを防ぎます。

THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mixは、SYBR™ Green I 検出系によるリアルタイムPCRのためのユニバーサル仕様のpassive reference dye を含むプレミックス試薬です。反応液調製が簡便化できるとともに、サンプル間の蛍光強度のばらつきが最小限に抑えられ、再現性の高い結果を得ることができます。

●増幅効率の向上
組成の改良によりPCR効率が向上しています。

●低コピー域の検出感度向上
高効率、かつ特異的な増幅により、広い測定レンジで解析が可能です。

●高い特異性
組成最適化により、PCR の特異性が向上しました。非特異反応の低減により低濃度ターゲットの検出における信頼性が向上しています。

●伸長時間10秒の高速サイクルにも対応

●調製後の反応液の安定性向上
プライマー・テンプレート混合後のPCR反応液の安定性が高いため、サンプル数が多く調製に時間がかかるような場合でも安定した結果が得られます。

●キャリーオーバーによる偽陽性防止
本製品の組成中にはdUTP が含まれています。
別売りのUracil-DNA Glycosylase(UNG),Heat-labile[Code No. UNG-101]を添加することで、キャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができます。

●補正用色素含有のため、ROX添加が不要
通常、補正が必要な装置においてもROXの添加が不要です。また、含有している補正用色素は、SYBR™ Green I の検出に影響を及ぼさないため、さまざまな機器に対応しています。

<対応機器例> メーカー 機器   Applied Biosystems   7300 / 7500 / 7500 Fast / StepOne™ / StepOnePlus™   ViiA™ 7 / QuantStudio®   Roche Diagnostics   LightCycler® 1. x / 2.0 / Nano / 96 / 480   Bio-Rad/MJ   MiniOpticon™ / CFX96 Touch   TaKaRa   Dice / DiceII / Dice Lite / Dice III   QIAGEN   Rotor-Gene Q   BioFlux   Line Gene

●着色済のため、分注ミスを低減

1.100～500bp領域の増幅

人工遺伝子を鋳型に、フォワードプライマーを共通として 増幅産物⾧が100bp、200bp、300bp、400bp、500bpになるようリバースプライマーを設計しました。これらのプライマーを用いて、THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mixおよび各社リアルタイムPCR試薬にて10⁷～10¹コピーの増幅を行い、増幅⾧ごとのPCR効率の比較を行いました。その結果、他社品では増幅効率が低下あるいは検出不可となる400bp以上のターゲットでも本製品では、増幅効率の低下が認められませんでした。


増幅効率(PCR効率)とは?
希釈系列を用いて検量線を作成し、この検量線の傾き(Slope)から増幅効率を算出することができます。
例えば、検量線の傾き(Slope)の値が-3.322の場合、以下の通り算出されます。
E = 10^(-1/-3.322)-1 = 10^0.301-1 = 1.999-1 = 0.999(99.9%)
この値が 1 (100%) に近いほどPCR効率が高く、DNAが1サイクルごと2倍に増えている理想な状態となります。

2.1コピーからの増幅

1コピーのターゲットが増幅可能な場合、1コピーの検出数がポアソン分布から想定される検出数と同等になると考えられます。ポアソン分布からの理論値では、0コピーとなる確率が37%、1コピー以上になる確率が63%となります。
そこで、THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mixを用いて、希釈した1コピーのサルモネラゲノムを鋳型としN=96で検出を行いました。その結果、未検出が38.5%、検出が61.5%であり、ポアソン分布から想定される検出率と同等であり、1コピー相当が検出されることが示唆されました。

3.G3PDHの65bp領域の増幅

逆転写反応用試薬 ReverTra Ace^® qPCR RT Kit [Code No.FSQ-101]により合成したHeLa細胞total RNA由来のcDNAを用い、cDNAの5倍希釈(5段階)について、増幅⾧65bpのG3PDHの増幅を行いました。

その結果、THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mix以外では低コピー域で非特異増幅が発生しましたが、本製品では、非特異増幅が認められず、低コピーまで定量が可能でした。










 

4.調製したPCR反応液の安定性

PCR反応液にプライマー、テンプレート(HeLa細胞total RNA由来のcDNA)を混合した直後または遮光室温で48時間インキュベートした後にターゲットの増幅を行いました。その結果、他社品では、48時間後でCt値の低下が認められましたが、THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mixでは、48時間後でも安定性した性能を示しました。ΔCtが0.5以上の差を黄色ハイライトで示しています。

5.UNG添加によるキャリーオーバーコンタミネーション防止効果

エンテロウイルスRNAを鋳型とし、dUTPを含むRT-PCR試薬で196bpのターゲットの増幅を行いました。そのPCR産物(10⁴コピー)を鋳型とし、THUNDERBIRD^®Next SYBR™ qPCR MixとUracil-DNA Glycosylase(UNG), Heat-labile[Code No. UNG-101]を添加し、リアルタイムPCRにて1回目のPCRと同じターゲットの増幅を行いました。

その結果、UNG処理を行うことで1回目のPCR産物が分解され、2回目のPCRでは、増幅が認められませんでした。

6.通常サイクル・高速サイクルの比較

逆転写反応用試薬 ReverTra Ace^® qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101]によりHeLa細胞から合成したcDNAを用い、5倍希釈(5段階)について、ターゲット長316bpのβ-actinの増幅を「伸長時間30秒の通常サイクル」および「伸長時間10秒の高速サイクル」で行いました。
その結果、通常サイクルを推奨する他社品では、高速サイクルで効率的な増幅ができませんでしたが、THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mixでは、高速サイクルにおいても効率的な増幅が可能でした。

<通常サイクル>					<高速サイクル>
95℃	60sec.				95℃	30sec.
95℃	15sec.		40cycles		95℃	3sec.		40cycles
60℃	30sec.				60℃	10sec.
融解曲線解析					融解曲線解析

<製品使用文献>
Takai J. et al., iScience 24, August 20,102836 (2021)
https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102836