高効率リアルタイムPCR用マスターミックス

THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mix

TOYOBO

価格表

Code No. 包装 価格(税別) キャンペーン
価格(税別)
保存温度 説明書
仕様書
SDS 法規制
QPX-201 1.67mL×3本
(500回用/20μL反応)
¥29,000 ¥17,400 -20℃ なし
QPX-201T 1mL×1本
(100回用/20μL反応)
¥8,500 -20℃ なし
QPX-201X5 (1.67mL×3本)×5
(500回用/20μL反応)×5
¥133,000 -20℃ なし

THUNDERBIRD Next SYBR™ qPCR/RT Set

品名 Code No. 包装 価格(税別) キャンペーン
価格(税別)
保存温度 説明書
仕様書
SDS 法規制
THUNDERBIRD Next SYBR qPCR/RT Set
QPX201/FSQ101 QPX-201とFSQ-101のセット ¥63,000 ¥37,800 -20℃ なし
THUNDERBIRD Next SYBR qPCR/RT Set II
QPX201/FSQ201 QPX-201とFSQ-201のセット ¥63,000 ¥37,800 -20℃ なし
THUNDERBIRD Next SYBR qPCR/RT Set III
QPX201/FSQ301 QPX-201とFSQ-301のセット ¥65,000 ¥39,000 -20℃ なし

キャリーオーバーコンタミネーション防止試薬とのセット品

品名 Code No. 包装 価格(税別) キャンペーン
価格(税別)
保存温度 説明書
仕様書
SDS 法規制
THUNDERBIRD Next SYBR qPCR/UNG Set
QPX201/UNG101 QPX-201とUNG-101のセット ¥39,000 ¥23,400 -20℃ なし

用途

●リアルタイムPCR

説明

THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mixは、従来品のTHUNDERBIRD® qPCR Mix の組成を大幅に改良した製品です。PCR効率を上げ、非特異反応(プライマーダイマー等の発生)を抑えることで、幅広い定量可能域(ダイナミックレンジ)を得ることができます。

2×濃度のプレミックス試薬になっており、プライマー以外の成分があらかじめ混合されています。また、リアルタイムPCR反応やシグナルには影響のない、青色の色素で着色されており、ピペッティングの際に試薬が見やすいため、分注ミスを防ぎます。

THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mixは、SYBR™ Green I 検出系によるリアルタイムPCRのためのユニバーサル仕様のpassive reference dye を含むプレミックス試薬です。反応液調製が簡便化できるとともに、サンプル間の蛍光強度のばらつきが最小限に抑えられ、再現性の高い結果を得ることができます。

特長

●増幅効率の向上
組成の改良によりPCR効率が向上しています。

●低コピー域の検出感度向上
高効率、かつ特異的な増幅により、広い測定レンジで解析が可能です。

●高い特異性
組成最適化により、PCR の特異性が向上しました。非特異反応の低減により低濃度ターゲットの検出における信頼性が向上しています。

●伸長時間10秒の高速サイクルにも対応

●調製後の反応液の安定性向上
プライマー・テンプレート混合後のPCR反応液の安定性が高いため、サンプル数が多く調製に時間がかかるような場合でも安定した結果が得られます。

●キャリーオーバーによる偽陽性防止
本製品の組成中にはdUTP が含まれています。
別売りのUracil-DNA Glycosylase(UNG),Heat-labile[Code No. UNG-101]を添加することで、キャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができます。

●補正用色素含有のため、ROX添加が不要
通常、補正が必要な装置においてもROXの添加が不要です。また、含有している補正用色素は、SYBR™ Green I の検出に影響を及ぼさないため、さまざまな機器に対応しています。


<対応機器例>
  Applied Biosystems   7300 / 7500 / 7500 Fast / StepOne™ / StepOnePlus™
  ViiA™ 7 / QuantStudio®
  Roche Diagnostics   LightCycler® 1. x / 2.0 / Nano / 96 / 480
  Bio-Rad/MJ   MiniOpticon™ / CFX96 Touch
  TaKaRa   Dice / DiceII / Dice Lite / Dice III
  QIAGEN   Rotor-Gene Q
  BioFlux   Line Gene


●着色済のため、分注ミスを低減

実施例

1.100~500bp領域の増幅

人工遺伝子を鋳型に、フォワードプライマーを共通として 増幅産物⾧が100bp、200bp、300bp、400bp、500bpになるようリバースプライマーを設計しました。これらのプライマーを用いて、THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mixおよび各社リアルタイムPCR試薬にて10⁷~10¹コピーの増幅を行い、増幅⾧ごとのPCR効率の比較を行いました。その結果、他社品では増幅効率が低下あるいは検出不可となる400bp以上のターゲットでも本製品では、増幅効率の低下が認められませんでした。


増幅効率(PCR効率)とは?
希釈系列を用いて検量線を作成し、この検量線の傾き(Slope)から増幅効率を算出することができます。
例えば、検量線の傾き(Slope)の値が-3.322の場合、以下の通り算出されます。
E = 10(-1/-3.322)-1 = 100.301-1 = 1.999-1 = 0.999(99.9%)
この値が 1 (100%) に近いほどPCR効率が高く、DNAが1サイクルごと2倍に増えている理想な状態となります。

2.1コピーからの増幅

1コピーのターゲットが増幅可能な場合、1コピーの検出数がポアソン分布から想定される検出数と同等になると考えられます。ポアソン分布からの理論値では、0コピーとなる確率が37%、1コピー以上になる確率が63%となります。
そこで、THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mixを用いて、希釈した1コピーのサルモネラゲノムを鋳型としN=96で検出を行いました。その結果、未検出が38.5%、検出が61.5%であり、ポアソン分布から想定される検出率と同等であり、1コピー相当が検出されることが示唆されました。

3.G3PDHの65bp領域の増幅

逆転写反応用試薬 ReverTra Ace® qPCR RT Kit [Code No.FSQ-101]により合成したHeLa細胞total RNA由来のcDNAを用い、cDNAの5倍希釈(5段階)について、増幅⾧65bpのG3PDHの増幅を行いました。

その結果、THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mix以外では低コピー域で非特異増幅が発生しましたが、本製品では、非特異増幅が認められず、低コピーまで定量が可能でした。










 

4.調製したPCR反応液の安定性

PCR反応液にプライマー、テンプレート(HeLa細胞total RNA由来のcDNA)を混合した直後または遮光室温で48時間インキュベートした後にターゲットの増幅を行いました。その結果、他社品では、48時間後でCt値の低下が認められましたが、THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mixでは、48時間後でも安定性した性能を示しました。ΔCtが0.5以上の差を黄色ハイライトで示しています。

5.UNG添加によるキャリーオーバーコンタミネーション防止効果

エンテロウイルスRNAを鋳型とし、dUTPを含むRT-PCR試薬で196bpのターゲットの増幅を行いました。そのPCR産物(10⁴コピー)を鋳型とし、THUNDERBIRD®Next SYBR™ qPCR MixとUracil-DNA Glycosylase(UNG), Heat-labile[Code No. UNG-101]を添加し、リアルタイムPCRにて1回目のPCRと同じターゲットの増幅を行いました。

その結果、UNG処理を行うことで1回目のPCR産物が分解され、2回目のPCRでは、増幅が認められませんでした。

6.通常サイクル・高速サイクルの比較

逆転写反応用試薬 ReverTra Ace® qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101]によりHeLa細胞から合成したcDNAを用い、5倍希釈(5段階)について、ターゲット長316bpのβ-actinの増幅を「伸長時間30秒の通常サイクル」および「伸長時間10秒の高速サイクル」で行いました。
その結果、通常サイクルを推奨する他社品では、高速サイクルで効率的な増幅ができませんでしたが、THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mixでは、高速サイクルにおいても効率的な増幅が可能でした。


<通常サイクル>     <高速サイクル>
95℃ 60sec.       95℃ 30sec.    
95℃ 15sec. 40cycles   95℃  3sec. 40cycles
60℃ 30sec. 60℃ 10sec.
融解曲線解析   融解曲線解析


参考文献

<製品使用文献>
Takai J. et al., iScience 24, August 20,102836 (2021)
https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102836

製品内容
【QPX-201T】
THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mix
1mL×1本*
【QPX-201】
THUNDERBIRD® Next SYBR™  qPCR Mix
1.67mL×3本*

*passive reference dye 含有

本製品には青色の色素が含まれています。
分注済みのwell は青色であるため、分注ミスを低減できます。
この色素はqPCR 反応やシグナルには影響しません。

基本反応条件
滅菌水 XμL
THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mix 10μL
Forward Primer 6pmol
Reverse Primer 6pmol
UNG*[Code No:UNG-101] 0.4U
DNAサンプル YμL
Total Volume 20μL

(UNG*反応 20~25℃ 10min.)

*UNG 処理(オプション):UNG は本製品中には含まれません。別売のUracil-DNA Glycosylase(UNG),Heat-labile[Code No. UNG-101] をご使用いただいた場合の温度条件および反応時間を一例として示しております。

〈2ステップPCR〉: 高速
95℃, 30sec.
  ↓
95℃, 5sec.
60℃, 10sec.*
40 cycles
*伸長時間を10秒に設定できない装置もあります。

〈2ステップPCR〉: 通常
95℃, 30sec.
  ↓
95℃, 5sec.
60℃, 30sec.
40 cycles

〈3ステップPCR〉: Tm が通常(60℃)よりも低いまたは、十分な反応効率が得られない場合にお試しください。

95℃, 20~60sec.
  ↓
95℃, 1~5sec
55~65℃, 5~30sec.
72℃, 10~60sec.
40 cycles 

備考

SYBR™ は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。

ワンポイントアドバイス

保存について
凍結融解の繰り返しは、10回程度では品質に影響がないことが確認されています。
融解後、3 ヶ月以内を目安に、2~8°C で冷蔵保存することができます。
長期間使用しない場合、-20°Cで再度凍結保存してください。
SYBR™ Green Iの蛍光減衰を防ぐため、保存の際は遮光してください。

FAQはこちら →

   トラブルシューティングは
こちら


試供品評価結果アンケート


本サイト右上の「サンプル請求」ボタンから、サンプルをお申込みいただくことが可能です。ご試用後、アンケートにご協力いただければ幸いです。

※ 法規制について
毒: 毒物及び劇物取締法[医薬用外毒物]
国: 国民保護法[毒素]
劇: 毒物及び劇物取締法[医薬用外劇物]
組: カルタヘナ法(遺伝子組換え生物等の使用等の規制による
危: 消防法[危険物]
   生物の多様性の確保に関する法律)
P: PRTR法(化学物質排出把握管理促進法)[届け出義務物質]
申: ご購入時に申込書の提出が必要な製品
労: 労働安全衛生法[通知または表示義務物質]
なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品

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