ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix
シリーズ

ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix シリーズは、高効率逆転写酵素「ReverTra Ace^®」を用いて開発された、リアルタイムPCR用の逆転写反応キットです。逆転写反応に必要な成分を全て含んだ5x濃度の完全プレミックス試薬であり、鋳型RNAと水を添加するだけで、迅速に反応を開始することができます。
ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover は、さらに強力なDNA分解活性を有するgDNA Removerを付属しており、逆転写反応前に鋳型RNAを処理することによって、ゲノムDNAフリーのcDNAを簡便に合成することができます。検出するターゲットに偽遺伝子が存在する場合や、イントロンをまたぐ位置にプライマーを設定できない場合など、鋳型RNAにコンタミするゲノムDNAの残存が問題となるリアルタイムPCR実験に最適です。

●リアルタイムPCR試薬との高い適合性
リアルタイムPCRの反応系への影響を最小限に抑える組成を採用しており、最大で20%液量の逆転写反応液をPCRに添加した場合でも、高い直線性を示します。発現量が少ないmRNAの高感度検出にも最適です。

●簡便、迅速にゲノムDNAを除去
ゲノムDNA除去試薬と逆転写反応試薬を順次添加するだけの約20分の操作で、ゲノムDNAフリーのcDNAの合成が可能です。

●完全プレミックス試薬
-20℃においても凍結しない完全プレミックスタイプの試薬です。鋳型RNAと水を加えるだけの操作で、簡便に再現性良くcDNAを合成することができます。

●逆転写反応(-)コントロールの調製が容易
プレミックスタイプのno-RT Controlが付属していますので、逆転写反応(-)のコントロールも容易に調製することができます。

●幅広いダイナミックレンジを実現
Oligo dT とRandom Primerの最適な混合比を持つプライマーミックスの採用により、RNAの全領域を均一に、高い効率で逆転写反応を行うことができ、広いダイナミックレンジでの解析が可能となります。

1. gDNA RemoverによるゲノムDNA除去効果の確認

gDNA RemoverによるゲノムDNAの除去効果を確認するため、下記の条件にて逆転写反応を行い、続いてβ-Actin遺伝子をターゲットにリアルタイムPCRを行いました。その結果、gDNA Remover処理(+)、逆転写酵素[RTase](-)<下記③>の条件では増幅が見られないことから、確実にゲノムDNAが除去されていることが示されました。



 ●cDNA合成
試薬 : ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover[Code No.FSQ-301] 
鋳型 : 自家調製したHeLa total RNA 0.5μg /10μL反応系
条件 : gDNA Remover添加(+)、あるいは無添加(-)の4×DN Master Mixを用いてgDNA除去反応を行った後、それぞれをさらに、5×RT Master Mix IIあるいは5×RT Master Mix II no-RT Controlを用いて逆転写反応を実施。

●リアルタイムPCR
試薬 : THUNDERBIRD^® SYBR™ qPCR Mix [Code No.QPS-201]
鋳型 : 上記cDNA2μL/20μL反応系(持込量10%)   Target : ACTB(188bp)
測定 : Applied Biosystems^® 7900HT

2.他社品とのゲノムDNA除去能の比較

HeLa total RNAに大過剰のヒトゲノムDNAを添加したモデル実験にて、同タイプの他社キットとのゲノムDNA除去能の比較を行いました。その結果、ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix with gDNA Removerが最もゲノムDNA除去能に優れていることが示されました。


●cDNA合成
試薬 : ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover[Code No.FSQ-301] および同タイプの
　　　他社キット2種
鋳型 : HeLa total RNA(0, 1pg, 10pg, 100pg, 1ng, 10ng, 100ng, 1μg)+ ヒトgDNA 100ng/20uL反応系
条件 : 各社キットの推奨条件に従って実施

●リアルタイムPCR
試薬 : THUNDERBIRD^® SYBR™ qPCR Mix [Code No.QPS-201]
鋳型 : 上記cDNA 2μL/20μL反応系(持込量10%)　　Target : ACTB(188bp)
測定 : Applied Biosystems^® 7900HT

実施例3:他社プレミックス試薬との逆転写反応効率(cDNA合成量)の比較
実施例4:鋳型RNA量に対する反応効率の検討
実施例5:cDNA特異的検出例 -夾雑ゲノムDNA除去性能の確認-

1)K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226(2003)
2)A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66(2002)
3)S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246(2002)
4)S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460(2001)
5)Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675(2000)
6)S.Lee et al.,Gene,245:253−266(2000)

<製品使用文献>
Takai J. et al., iScience 24, August 20,102836 (2021)
https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102836

cDNA合成キット選択ガイド