ReverTra Ace^®

RNaseH活性は、cDNA合成において鋳型/プライマーであるDNA-RNAハイブリッドのRNAを分解し、反応効率等の低減の原因となることが知られています。ReverTra Ace^®は、M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) RTase遺伝子のRNaseH活性ドメインに点変異を導入することにより、この活性を低減しています。

また、RNAの高次構造はRTaseの反応の進行を妨げ、cDNAの合成を困難にします。本酵素は、DNA合成ドメインに点変異を導入することで反応効率、及び高温反応性を向上させることで、高温下での反応を可能としています。よって、反応温度を上げることにより鋳型RNAの高次構造を緩和し、RTaseによるcDNA合成反応を促進することができます。

本酵素は、従来のデリーションタイプのM-MLV RTase RNaseH^-に比べ約4倍の比活性を持ち、高効率なcDNA合成に適しています。

●伸長性が向上

M-MLV RTaseのRNaseH活性を除去することにより伸長性が格段に向上しています。
 

●反応効率・高温反応性が向上

M-MLV RTaseのDNA合成ドメインの改変、及び反応組成の改良により、高温反応性、及び反応効率が向上しています。
 

●RT-PCRに最適

さまざまな条件で逆転写反応を行うことができ、特にRT-PCRに適しています。

1.42～60℃におけるcDNA合成反応

poly(A) Tailを持つ9.49、7.46、4.40、2.37、1.35kbのRNA 0.4μgを鋳型に42～60℃の反応温度でoligo(dT)₂₀ 25pmolesをプライマーとし、酵素100Uを用いて30min.のcDNA合成反応を行いました。
その結果、ReverTra Ace^®では42℃及び50℃で9.49kb、55℃で4.4kb、60℃で2.37kbのcDNAの合成が確認されました。
 

2. cDNA合成効率の比較

in vitroで合成したG3PDHのRNA 10²～10⁵copiesを鋳型にG3PDHのReverse Primerを用い、42℃、20min.にてcDNA合成反応を行った後、G3PDHのForward Primerを加え rTaq DNA Polymerase[Code No.TAP-201] でPCRを行いました。
その結果、ReverTra Ace^®では10²copiesのRNAを用いてcDNA合成を行ったものについても高効率で増幅を行うことができました。
 

実施例3:14kbのcDNA合成反応
実施例4:GC-richターゲットからのcDNA合成
実施例5:反応効率・伸長性能と逆転写反応温度の検討

1)K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226(2003)
2)A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66(2002)
3)S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246(2002)
4)S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460(2001)
5)Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675(2000)
6)S.Lee et al.,Gene,245:253−266(2000)

商品使用文献
1)T. Ikeda et al., Endocrinology 142(4): 1419-1426.(2001)
https://doi.org/10.1210/endo.142.4.8070
2)S. Ohuchi et al., Nucleic AcidsResearch, 30(15): 3473-3480.(2002)
https://doi.org/10.1093/nar/gkf453
3)K. Minami et al., Toxicological Sciences 87(1): 296-305.(2005)
https://doi.org/10.1093/toxsci/kfi235
4)I. Nishimura et al., Endocrinology, 149(2): 774-782.(2008)
https://doi.org/10.1210/en.2007-0759