KOD SYBR™ qPCR Mix

KOD SYBR™ qPCR Mixは、SYBR™ Green I検出系によるリアルタイムPCR用 2×濃度のマスターミックス試薬です。本試薬は、ROX(別添)とプライマー以外の成分があらかじめ混合されています。そのため、反応液調製を簡便化できるとともに、サンプル間の蛍光強度のばらつきを最小限に抑えられ、再現性の高い結果を得ることができます。
本製品は、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性(校正活性)を除去したKOD exo(-) DNA polymeraseと最適化されたバッファー組成を組み合わせることで、KODの優れた合成能やクルード成分の阻害を受けにくいという性質をSYBR™ Green Iを用いるインターカレーションアッセイにおいて最大限に発揮させることを可能としました。

● 増幅困難なターゲットに対応

KOD DNA polymeraseを使用することで、Taq DNA polymeraseを用いる従来品では困難であったGCリッチなターゲット、塩基に偏りがあるような配列やプロモーター近傍の2次構造をとりやすいようなターゲットにおいても、定量的な増幅が認められます。(実施例1)
 

●長鎖ターゲット(～2kb)に対応

KOD FXやKOD -Plus- シリーズなどの通常のPCR用に設計したプライマーをそのままご使用頂けます。長鎖ターゲットでも増幅できるためプライマーの選択幅を格段に広げることができます。

2kbまでのさまざまなターゲット長を選択できるため、幅広い融解曲線解析が可能です。プライマーダイマーの発生領域(短鎖領域)を外して増幅領域を選べるため、エンドポイントアッセイでの多型解析、マルチプレックスPCR解析などに有利です。(実施例2)
 

●クルードサンプルを用いる解析が可能

植物ライセート、マウステールアルカリ熱抽出液、血液などのクルードサンプルを用いて直接検出することができます。SYBR™ Greenアッセイを応用することで、煩雑だった多型解析やSNP解析を簡便化することができます。(実施例3, 実施例4, 実施例5 )

●高い特異性

プライマーダイマーなどの非特異反応を抑えることで、低コピー域までの幅広い定量が可能です。また、弊社リアルタイムPCR用cDNA合成キット「ReverTra Ace^® qPCR RTシリーズ」を併用することで安定した検出を得ることができます。(実施例6)
 

●さまざまな機器に対応

ブロックタイプの機器(Fast Modeにも対応)のほか、ガラスキャピラリーを用いる高速サイクラーにも対応しています。また50× ROX reference dyeが別添付されているため、パッシブリファレンスを必要とする機器においても各機器に適したROX濃度でご使用になれます。

【対応可能機器例】

機　器	ROX 最終濃度 (添加量)
Applied Biosystems® 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、StepOnePlus™	1× (1/50量)
Applied Biosystems® 7500、7500Fast、 ViiA™、QuantaStudio、  Agilent Technologies Mx3000P、Mx3005P、Mx4000	0.1× (1/500量)
Roche Diagnostics LightCycler® 2.0、LightCycler® Nano、 Bio-Rad MiniOpticon™、  CFX96 Touch™、 BioFlux Line Gene	不要

1.増幅困難なターゲットの検出

●GCリッチなターゲット
GC含量が70%を超えるターゲットに対し、各リアルタイムPCR試薬による反応性の比較を行いました。鋳型には、弊社の高性能逆転写反応用試薬 ReverTra Ace^® qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101] により合成したHeLa細胞total RNA由来のcDNAを用い、cDNAの5倍希釈(5段階)について、反応を実施しました。その結果、弊社従来品では、増幅困難であったGC-richなターゲットに対しても、定量的な増幅が認められました。また、反応特異性が高く、プライマーダイマーが生じにくいため、低コピーまでの幅広い定量可能域を得ることができました。


                              図 GCリッチなターゲットに対するリアルタイムPCR(ABI StepOnePlus^TM 使用)

●GC含量に偏りがあるターゲット
ヒトゲノムをテンプレートとして、配列中の赤字で示した部分をPrimer配列として使用し、解析を行いました。
その結果、本品では定量的な増幅が認められ、2次構造をとりやすいターゲットにおいても有効であることが確認できました。


          図 GC含量に偏りのあるプロモーター領域に対するリアルタイムPCR(ABI StepOnePlus^TM 使用)
 

2.長鎖ターゲットの検出

●2kbターゲットの解析
KOD FXシリーズやKOD-Plus-シリーズで増幅可能なプライマーを用い、約2kbのターゲットの増幅を実施しました。その結果、Taq DNAポリメラーゼを用いる従来品では増幅困難な約2kbのターゲットでも本品では定量的な増幅が認められました。

     図 長鎖ターゲットに対するリアルタイムPCR(ABI StepOnePlus^TM使用)

●増幅長が異なるターゲットの解析
ヒトゲノムDNAを鋳型にβ-アクチン遺伝子上の増幅長が異なるターゲットの増幅、及び融解曲線解析を実施しました。その結果、60bp～約1kbまでの増幅産物が得られ、74～87℃の幅広い温度域で今回増幅した増幅産物の識別が可能でした。そのため、増幅長を変え融解温度に差異が生じるようにプライマーを設計することでワンチューブで複数のターゲットの検出が可能となります。この融解曲線の差異はGC含量に左右されますが、増幅産物のTm値を計算することで予測可能です。


    図 増幅長が異なるターゲットを用いた解析(ABI7500使用)

3.クルードサンプル(マウステール)の検出

マウステールアルカリ熱抽出液を用いワンチューブでジェノタイピング解析を実施しました。WT特異的増幅産物とknock-in特異的増幅産物の増幅長を変えることで、計算上、増幅産物のTm値に差異が生じるように設計しました。WT特異的プライマーは、CreER knock-inに対しては、増幅長が長いため、伸長時間を30秒と短くすることで増幅できないようにしています。また、ヘテロ検出におけるピーク比のバランスをとるために、WT特異的プライマー:knock-in特異的プライマー=1:3として検出の結果、すべてのタイプで増幅が認められジェノタイピングを実施することができました。


    図. 融解曲線解析を用いるワンチューブマウスジェノタイピング(ABI 7500使用)
 

その他の実施例

<クルードサンプルの解析例>
実施例4: ASP(Allele specific primer)-PCRを用いるSNP(Single nucleotide polymorphism)解析
実施例5: 植物葉からの検出
実施例8: クルードサンプル(菌液)を用いたリアルタイムPCR
実施例9: 生物農薬糸状菌の特異的検出及び定量
<増幅が困難なターゲットの成功例>
実施例6: プライマーダイマーが生じやすいターゲットの検出
実施例7: ゲノムDNA相対定量 
実施例10: ChIPターゲットの効果的な増幅

1) R.M. de Breuil et al., PCR Methods Appl., 3 : 57-59 (1993)