DNA末端平滑化プロトコール 2

「KOD -Plus-」[Code No. KOD-201]、「KOD -Plus- Ver.2」[Code No. KOD-211]、「KOD -Plus- Neo 」[Code No. KOD-401]、「KOD FX」[Code No. KFX-101]、「KOD FX Neo」[Code No. KFX-201]、「KOD One^® PCR Master Mix」[Code No. KMM-101] のいずれかのDNA Polymerase を用いた DNAの末端の平滑化プロトコールです。ライゲーションには「Ligation high」[Code No. LGK-101]を使用します。
「KOD DNA Polymerase」 [Code No. KOD-101]を用いたプロトコールはこちら。

(1) Sample DNA が XμL の場合、平滑化反応液を以下の通り調製します。

反応液を調製する前に各試薬を十分攪拌してからご使用ください。凍結している試薬は完全に融解してください。

* 各製品のパーツです。

全ての液を添加した後、反応液をボルテックスなどで十分攪拌してからサーマルサイクラーにセットしてください。

(2) 94℃、2min.インキュベートします。

(3) 氷中で冷却します。

(4) Sample DNA XμLを平滑化反応液に加え、十分に攪拌し、サーマルサイクラーにセットします。

(5) 72℃、2min.インキュベートします。

(6) 氷中で冷却します。

(7) 反応液をそのままライゲーション反応に使えます。

(ライゲーション反応の例)

16℃、1hrインキュベートします。

※平滑化処理をうまく行うために

1. ① エタノール沈殿などで、TEバッファーに置換したDNAの使用を標準的な操作としていますが、次の方法でも可能です。
   <制限酵素処理したDNAの場合>
   H,M,L,TAバッファーを用いた反応液であれば、反応液をそのままDNA溶液として用い、上の反応組成で平滑化処理できます。
   
   <Taq系DNA polymeraseを用いてPCRを行った産物の場合>
   「KOD DNA Polymerase」 [Code No. KOD-101]を用いた平滑化プロトコールをお勧めします。プロトコールはこちら
   
2. ② DNA末端10pmolを処理できます。直鎖状pUC18 DNA2.7kbであれば、約10μgに相当します。
   
3. ③ 72℃,2min.で充分な平滑化反応が行われます。また、標準の反応条件であれば、30min.まで時間を延長しても効率は変わりません。