Ligation high

T4 DNA Ligaseを主体とした高効率な1液タイプのライゲーション試薬です。さまざまな末端を持つDNAの連結反応に広く用いることができます。
凍結/融解に対する安定性や反応効率向上のために組成条件を至適化していま
す。ライゲーションに必要な、rATP、DTTなどを含んだ1液タイプのライゲーション試薬です。DNAサンプル溶液の半分量～同量のLigation highを加えるだけで、T4 DNA Ligase単体で用いた場合よりも、良好な結果を得ることができます。

●簡便

DNAサンプル溶液にLigation highを混合するだけで、高効率なライゲーションを行うことができます。
 

●高効率

T4 DNA Ligaseを単独で用いた場合に比べ、50倍以上の効率が得られます。
 

●優れた安定性

50回の凍結/融解を行ってもライゲーション効率の低下は認められません。

1.凍結融解に対する安定性

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凍結融解後、推奨プロトコールに沿ってライゲーション反応を行いました。その結果、50回の凍結融解後も安定であることがわかりました。
 

2.塩濃度の影響

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DNA溶液に含まれる塩(NaCl)の濃度がライゲーション効率に及ぼす影響を検討しました。評価は、pBluescript^®ⅡをSacⅠで切断した断片(5ng)をNaCl濃度の違うTE Buffer 5μLに溶解し、DNA溶液中に含まれる塩成分がセルフライゲーションの効率にどれくらい影響するかを指標としました。方法としては、DNA断片溶液に等量又は半分量のLigation highに加え、16℃で30min.反応させた後、2μLを形質転換に用い、生じたコロニー数を計測しました。その結果、NaCl濃度が高いほど、ライゲーション効率が下がることが示されました。　よって、制限酵素のH Bufferなど、塩濃度が高いDNA溶液をライゲーションに使用する場合は、一度TE Buffer等に置換することをお勧めします。

3. PCR産物のTAクローニングにおける反応時間の影響

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本キットを用いて、PCR産物をTベクターに挿入し、時間の影響を調べました。実験法としては、まず、λDNAの500bpをターゲットにrTaq DNA PolymeraseでPCRを行い、その反応液1μL (約6.4ng)と2μLのTベクター(50ng)を3μlのLigation highに加え、16℃にて各反応時間インキュベーションし、ライゲーション反応を行いました。その後、反応液2μLで大腸菌を形質転換し、プレート上に生じた白コロニー及び青コロニーの数を測定しました。その結果、反応時間が長いほど効率が増加し、16時間で最高となることが分かりました。また、青コロニーの数は、2時間以上では変化はありませんでしたが反応時間が長いほど白色コロニーの数が増加しています。よって、Ligation highを用いたPCR産物のTAクローニングにおいて、高い挿入率を得たい場合には2時間以上、好ましくは16時間以上反応させることをお勧めします。

※短時間でのTAクローニングをご希望の場合はLigation high Ver.2をお薦めします。
 

4. 反応時間の検討

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λ/HindⅢをインサートとして、Ligation highを用いて16℃にて各反応時間ライゲーションを行い、エタノール沈殿後、電気泳動を行いました。その結果、HindIII切断末端においては、約5分でも充分ライゲーション反応が完了していることが明らかになりました。

1)R. L. Hawkins et al., Current Microbiol., 38: 335-341(1999)

製品使用文献
1)H. Kamiya et al., Nucleic Acids Research, 28(7): 1640-1646. (2000)
2)H. Kamiya et al., Biol.Pharm.Bull.,27(5): 621-623(2004)
3)Tatsuya Suzuki et al., AnalyticalSciences, 23(1): 65-70 (2007)