GenNext^®RamDA-seq^® Single Cell Kit

本キットは RT-RamDA^®(Reverse Transcription with Random Displacement Amplification)法を採用した製品です。RT-RamDA^®法は逆転写酵素の鎖置換活性を利用した新規cDNA増幅方法であり、poly(A) RNAだけでなく、non-poly(A)由来のcDNAの高感度な検出が可能です。このためRT-RamDA^®法では従来技術に比べ検出遺伝子が多いことが特徴です。


GenNext^® RamDA-seq^®Single Cell Kit [Code No. RMD-101, RMD-101T] はシングルセルや微量のRNAからNGS解析用のcDNAを合成するためのキットです。本キットをご使用いただくことでRNA全長をカバーした解析のためのcDNAを合成することが可能です。
(ライブラリー調製には、本製品の他、磁性ビーズ Agencourt AMPure XP試薬 (Beckman Coulter社) およびライブラリー調製試薬Nextera^® XT DNA Sample Preparation Kit (イルミナ社)が必要です。)
RT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit [Code No. RMD-201, RMD-201T] はシングルセルや微量のRNAからリアルタイムPCR解析用のcDNAを合成するためのキットです。本キットで合成したcDNAは、高感度に遺伝子発現解析を行うことができます。

●シングルセルや微量RNAに対応

1~100細胞または10pg~1ng total RNA からcDNAの合成が可能です。
 

●RNA全長をカバーするcDNAの合成が可能

Oligo-dT primer のみを用いる従来法では困難であった10kb以上のターゲットRNAからcDNAの合成が可能であり、RNA全長からシーケンスリードが得られます。
 

●poly(A) RNAに加え、non-poly(A) RNAの検出が可能

Oligo-dT primer に加え、NSR(Not so random primer)を使用しており、従来法では検出できなかったnon-poly(A) RNAの検出も可能です。
 

●検出遺伝子数がアップ

ヒストンRNA、IncRNA、pre-mRNA、circRNAなどを含むさまざまなRNAの検出ができます。

RamDA-seq^®(ラムダセック)は、国立研究開発法人理化学研究所 生命機能科学研究センター バイオインフォマティクス研究開発チームが開発した「Random Displacement Amplification Sequencing」の略です。
既存の1細胞RNA解析法では、Oligo-dT primerのみを用いて逆転写するため、non-poly(A) RNAは合成できず、また途中でcDNA合成が止まった場合、全長の検出が困難でした。一方、RamDA-seq^®法では、random primerあるいはNSR primer^*を使用するため、poly(A)配列以外からも合成が可能であり、non-poly(A) RNAを検出できます。また、これらprimerがRNAのさまざまな場所に結合しcDNA合成が開始されるため、RNA全長からシーケンスリードを得ることができます。
さらにRamDA-seq^®法は、cDNAが合成と同時に増幅されるため、従来法で実施している増幅用アダプター付加やPCRが必要なく、増幅によるバイアスを抑えることが可能です。

*NSR primerとは、Not so random primerの略で、18S, 28S RNA遺伝子に完全にマッチする配列を計算上除外したrandom primer のことです。random primer の代わりにNSR primerを用いることで、rRNAからのcDNA合成を抑制できます。

ヒト用、マウス用のNSR primerをご用意しております。ヒト由来のサンプルにはNSR Primer Set for human [Code No. NSR-101] を、マウス由来のサンプルにはNSR Primer Set for mouse [Code No. NSR-102] のご使用をお勧めします。



※RamDA-seq^®とRT-RamDA^® は国立研究開発法人理化学研究所の登録商標です。

1. cDNA増幅率の検証

従来の逆転写反応試薬およびRT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit を用いて NIH3T3 total RNA 10pg からcDNAを合成し、THUNDERBIRD^® SYBR™ qPCR Mix[Code No. QPS-201]にてリアルタイムPCRを行って各遺伝子を測定しました。
その結果、従来の逆転写反応試薬で得られたcDNA量に対して、RT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit では9 倍以上のcDNA を得ることができました。

2. インプットRNA量の検証

10pg と1ngのNIH3T3 total RNA を用いてRT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit にてcDNA を
合成し、リアルタイムPCR により8 遺伝子(N=3
で実施)のCt 値を比較しました。その結果、10pg
インプットと1ng インプットで高い相関が認められ、微量のインプット量からもcDNA 合成が可能でした。

3. カバレッジの均一性の確認

mES total RNA 10pg から GenNext^®RamDA-
seq^® Single Cell Kit にて、cDNA、二本鎖DNA
を合成し、次世代シーケンサー解析を行いました。
解析にはillumina^® MiSeq^® を使用しました。その
結果、調製したライブラリーがおおむね遺伝子
全体を均一にカバーしていることが確認できま
した。

実施例4:長鎖RNAにおけるcDNA合成の比較
実施例5:検出転写産物数の比較およびRNA種類別リード数の検証
実施例6:ランダムプライマーおよびNSR プライマー を用いた場合の rRNA混入率の比較
実施例7:微量RNAからのcDNA合成
実施例8:2nd鎖合成後の精製工程を省略したシングルセル解析用ライブラリー調製法

Hayashi, T. et al., Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9:619(2018)
https://doi.org/10.1038/s41467-018-02866-0

<製品使用文献>
Yoshimatsu, S. et al., Non-viral Induction of Transgene-free iPSCs from Somatic Fibroblasts of Multiple Mammalian Species. Stem Cell Reports, Volume 16:754-770(2021)
https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2021.03.002

Hasegawa, N. et al., Highly sensitive fusion detection using plasma cell-free RNA in non-small-cell lung cancers. Cancer Sci. 112(10):4393-4403(2021)
https://doi.org/10.1111/cas.15084