実施例

KOD -Plus- 実施例4 inverse PCRによる部位特異的変異導入

インバースPCRは相同部分のない逆方向の2種類のプライマーを用いてプラスミド全周をPCRで増幅する方法で、プライマーのデザインにより、塩基の置換や挿入、欠失を導入することができます。今回は、pUC19のlacZαペプチドの5'末端にHis-TagとBglⅡsiteを導入しました。(下図)

(部位特異的変異導入方法については、ライフサイエンス実験シリーズvol.8でも紹介しています。その他の実験シリーズはこちら)

【方法】
(1)変異導入
以下の条件でPCRを行いました。


 プライマー配列 :
 
      ※プライマーは、T4  Polynucleo Kinase を用いてより5'リン酸化を行いました。

PCR反応液30μL にLigation high [ Code No. LGK-101 ]を15μL 添加し、16℃、2hrインキュベーションしてPCR産物のセルフライゲーション反応を行いました。

ライゲーション反応液をエタノール沈澱し、17μlの滅菌水で再溶解しました。鋳型プラスミドの切断のため、DpnⅠ 20units [Code No. DPN-101] を10×Buffer 2μLと共に添加し、37℃で1hr反応させました。

反応液でCompetent high JM109  [ Code No. DNA-900 ] を形質転換しました。

(2)変異確認
形質転換を行ったE.coli JM109を終夜培養した寒天プレート上のコロニーについて、KOD Dash [ Code No. LDP-101 ]、M13プライマーによるコロニーダイレクトPCRを行いました。
 
PCR産物に制限酵素BglⅡを作用させ、切断の有無により変異挿入の有無を確認しました。
 
変異挿入を確認したコロニーについてシーケンスの確認を行いました。

【結果および考察】
目的の変異が挿入されている場合は173bpの断片が、元の鋳型のpUC19からは149bpの断片が増幅されます。BglⅡにより切断された場合、139bpと34bpの断片を生じます。

ランダムに選んだ90コロニー中、86コロニーについてコロニーダイレクPCR産物のBglⅡによる切断が確認されました。(右図は電気泳動結果の一部)

また、電気泳動で変異挿入を確認したコロニーについてシーケンスを行ったところ、His-TagとBglⅡsiteが正しく挿入されていることが確認できました。


☆KOD -Plus- による部位特異的変異導入を行うのに必要な試薬がセットになった、KOD -Plus- Mutagenesis Kit [ Code No. SMK-101 ] を販売しております。本Kit は、3ステップの簡単なプロトコールになっており、PCR産物のセルフライゲーションとリン酸化を同時に行いますので、リン酸化したプライマーを準備する必要がありません。Competent high DH5αとのセットになっている KOD -Plus- Mutagenesis DH5α Set [ Code No. SMK101/DNA903 ]もございます。

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