融解曲線解析によるマルチプレックスPCR解析などに最適。

高効率リアルタイムPCR Master Mix KOD SYBR® qPCR Mix

価格表

KOD SYBR® qPCR Mix

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
QKD-201 1.67ml×3本 ¥32,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
QKD-201T 1ml×1本 ¥9,800 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
QKD-201X5 (1.67ml×3本)×5 ¥147,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

KOD SYBR® qPCR / RT Set

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
KOD SYBR qPCR/RT Set QKD201/FSQ101 QKD-201とFSQ-101のセット ¥65,800 -20℃ 該当無し
KOD SYBR qPCR/RT Set II QKD201/FSQ201 QKD-201とFSQ-201のセット ¥65,800 -20℃ 該当無し
KOD SYBR qPCR/RT Set III QKD201/FSQ301 QKD-201とFSQ-301のセット ¥67,800 -20℃ 該当無し

用途

●リアルタイムPCR

説明

KOD SYBR® qPCR Mixは、SYBR® Green I検出系によるリアルタイムPCR用 2×濃度のマスターミックス試薬です。本試薬は、ROX(別添)とプライマー以外の成分があらかじめ混合されています。そのため、反応液調製を簡便化できるとともに、サンプル間の蛍光強度のばらつきを最小限に抑えられ、再現性の高い結果を得ることができます。
本製品は、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性(校正活性)を除去したKOD exo(-) DNA polymeraseと最適化されたバッファー組成を組み合わせることで、KODの優れた合成能やクルード成分の阻害を受けにくいという性質をSYBR® Green Iを用いるインターカレーションアッセイにおいて最大限に発揮させることを可能としました。
 

特長

● GCリッチなターゲットに対応

従来品では困難であったGC含量が70%を超えるターゲットにおいても、定量的な増幅が認められます。


図1. GC-richなターゲットに対するリアルタイムPCR(ABI StepOnePlusTM 使用)
GC含量が70%を超えるターゲットに対し、各リアルタイムPCR試薬による反応性の比較を行いました。鋳型には、弊社の高性能逆転写反応用試薬「ReverTra Ace® qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101]」により合成したHeLa細胞total RNA由来のcDNAを用い、cDNAの5倍希釈(5段階)について、反応を実施しました。その結果、弊社従来品では、増幅困難であったGC-richなターゲットに対しても、定量的な増幅が認められました。また、反応特異性が高く、プライマーダイマーが生じにくいため、低コピーまでの幅広い定量可能域を得ることができました。




図2. GC含量に偏りのあるプロモーター領域に対するリアルタイムPCR(ABI StepOnePlusTM 使用)
2次構造をとりやすいターゲットにおいても、本試薬が有効であることが確認できました。


 

●長鎖ターゲット(~2kb)に対応

KOD FXやKOD -Plus- シリーズなどの通常のPCR用に設計したプライマーをそのままご使用頂けます。長鎖ターゲットでも増幅できるためプライマーの選択幅を格段に広げることができます。



図3. 長鎖ターゲットに対するリアルタイムPCR(ABI StepOnePlusTM使用)
KOD FXシリーズやKOD-Plus-シリーズで増幅可能なプライマーを用い、約2kbのターゲットの増幅を実施しました。その結果、Taq DNAポリメラーゼを用いる従来品では増幅困難な約2kbのターゲットでも本品では定量的な増幅が認められました。


2kbまでの様々なターゲット長を選択できるため、幅広い融解曲線解析が可能です。プライマーダイマーの発生領域(短鎖領域)を外して増幅領域を選べるため、エンドポイントアッセイでの多型解析、マルチプレックスPCR解析などに有利です。



図4. 増幅長が異なるターゲットを用いた解析(ABI7500使用)
ヒトゲノムDNAを鋳型にβ-アクチン遺伝子上の増幅長が異なるターゲットの増幅、及び融解曲線解析を実施しました。その結果、60bp~約1kbまでの増幅産物が得られ、74~87℃の幅広い温度域で今回増幅した増幅産物の識別が可能でした。そのため、増幅長を変え融解温度に差異が生じるようにプライマーを設計することでワンチューブで複数のターゲットの検出が可能となります。この融解曲線の差異はGC含量に左右されますが、増幅産物のTm値を計算することで予測可能です。


 

●クルードサンプルを用いる解析が可能

植物ライセート、マウステールアルカリ熱抽出液、血液などのクルードサンプルを用いて直接検出することができます。SYBR® GreenⅠアッセイを応用することで、煩雑だった多型解析やSNP解析を簡便化することができます。

①増幅長多型を用いるジェノタイピング解析
2つの増幅産物の増幅長を変え、Tm値に差異が生じるようにプライマーを設計するだけでワンチューブでマウスのジェノタイピングを行うことができます(特長前項参照)。


図5. 融解曲線解析を用いるワンチューブマウスジェノタイピング(ABI 7500使用)
マウステールアルカリ熱抽出液を用いワンチューブでジェノタイピング解析を実施しました。WT特異的増幅産物とknock-in特異的増幅産物の増幅長を変えることで、計算上、増幅産物のTm値に差異が生じるように設計しました。WT特異的プライマーは、CreER knock-inに対しては、増幅長が長いため、伸長時間を30秒と短くすることで増幅できないようにしています。また、ヘテロ検出におけるピーク比のバランスをとるために、WT特異的プライマー:knock-in特異的プライマー=1:3として検出の結果、すべてのタイプで増幅が認められジェノタイピングを実施することができました。


②ASP(Allele specific primer)-PCRを用いるSNP(Single nucleotide polymorphism)解析
一方のプライマーの5’末端にGC tailを付加することにより、同サイズのターゲットの識別を融解曲線解析により行うことができます。様々な原理のASP-PCRに応用可能です。以下では、3’末端から2塩基目にSNP部位、3塩基目にミスマッチ部位となるように設計し、解析を行いました。


図6. 血液や口腔粘膜からの検出(ABI 7500 Fast 使用)
(A) ALDH2 SNP検出に用いたプライマーを示しています。ワンチューブで遺伝子型の識別を可能にするために、一方のアレル特異的プライマーにGC tai(l 下線部)を付加し、増幅産物の融解温度(Tm値)に差異が生じるように設計しました。GC tail付加による融解温度の上昇を大きくするため、増幅長を100bp以下にしています。また、この実施例においては、アレル特異的プライマーとして3’側から2塩基目をSNP部位(赤)、3塩基目をミスマッチ(緑)になるように設計しました。
(B) 血液の水希釈液、口腔粘膜の水懸濁液を20μl反応系に5μl添加し、検出を行いました。その結果、遺伝子型の判定が可能でした。


③クルードサンプル中のターゲットの検出
従来品のTaq DNA polymeraseを使用したリアルタイムPCR試薬では増幅困難であったクルードサンプルにおいても解析が可能となりました。


図7. クルードサンプルからのリアルタイムPCR検出(ABI 7500使用)
(A) ワンステップ法にて作製したイネライセート及び精製DNAを用いて、弊社従来品と本製品の比較を行いました。その結果、本製品ではライセートを用いて特異的な増幅が認められましたが、Taq DNA polymeraseを使用している従来品では増幅が認められませんでした。
(B) 増幅長が1.3kbのターゲットについて、増幅を実施しました。その結果、本製品ではライセートをサンプルとした場合においても特異的な増幅が認められました。


 

●高い特異性

プライマーダイマーなどの非特異反応を抑えることで、低コピー域までの幅広い定量が可能です。また、弊社リアルタイムPCR用cDNA合成キット「ReverTra Ace® qPCR RTシリーズ」を併用することで安定した検出を得ることができます。


図8. 他社リアルタイムPCR試薬との反応特異性比較(ABI StepOnePlusTM 使用)
プライマーダイマーが生じやすいターゲットにおいてリアルタイムPCRを行いました。その結果、本製品では、低コピーサンプルやno-template contro(l NTC)においてもプライマーダイマーが抑制され、良好な結果を得ることができました。


 

●様々な機器に対応

ブロックタイプの機器(Fast Modeにも対応)のほか、ガラスキャピラリーを用いる高速サイクラーにも対応しています。また50X ROX reference dyeが別添付されているため、パッシブリファレンスを必要とする機器においても各機器に適したROX濃度でご使用頂けます。



【対応可能機器例】


機器 ROX 最終濃度
(添加量)
 Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、
 StepOnePlus™
1×(1/50量)
 Applied Biosystems 7500、7500Fast、 Agilent Technologies
 Mx3000P、Mx3005P、Mx4000
0.1×
(1/500量)
 Roche社製機器(LightCycler® 2.0、LightCycler® Nanoなど)、
 Bio-Rad社製機器(MiniOpticon™、CFX96 Touch™など)、
 BioFlux Line Geneなど
不要

 

 

実施例

参考文献

1) R.M. de Breuil et al., PCR Methods Appl., 3 : 57-59 (1993)
2) P.M. Holland et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88 : 7276-7280 (1991)
 

製品内容

【QKD-201T】
qPCR Mix 1ml×1本
50X ROX reference dye 50μl
(50μl反応で40回用、20μl反応で100回用となります)

【QKD-201】
qPCR Mix 1.67ml×3本
50X ROX reference dye 250μl
(50μl反応で200回用、20μl反応で500回用となります)
 

基本反応条件

<インターカレーターアッセイ>
滅菌水  Xμl
qPCR Mix  10μl
Forward Primer  4pmoles
Reverse Primer  4pmoles
50×ROX referencre dye 0.4/0.04μl*
DNAサンプル  Yμl
Total Volume  20μl

*50X ROX reference dyeは、Applied Biosystems社製機器など、ウェル間の蛍光強度および分注誤差補正のためにパッシブリファレンスを用いる機器での反応の際に添加してください。また、補正を行わない機器では添加する必要はありません。


Cycle
98℃,  120sec.
    ↓
98℃,   10sec.
60℃*1,  10sec.
68℃,    30sec./500bp  40 cycles

*1 アニーリング温度は、プライマーの50~68℃の範囲に設定してください。

※伸長時間は、標的配列が500bp以下の場合は30秒で十分に反応が進行しますが、一部の機器では、安定した蛍光測定に30秒より長い時間を必要とする場合があります。増幅曲線のがたつきや、ウェル間の変動が大きい場合には、長めの時間(45~60秒)を設定してください。

備考

LightCycler® は、Idaho Technology Inc.の商標です。
SYBR® は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。
ABI PRISM® は、Applied Biosystems® Inc.の登録商標です。

ワンポイントアドバイス

●保存について
凍結融解の繰り返しは、10回程度では品質に影響がないことが確認されています。

●逆転写反応溶液の持込について
一般的な逆転写反応用試薬などを用いて合成したcDNA液を、精製せずに滅菌水などで適宜希釈して、そのままリアルタイムPCR反応液に添加してご使用いただくことができます。
添加量は反応液量の10%を上限の目安としてください。ReverTra Ace® qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101]、ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix [Code No. FSQ-201]、ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover [Code No. FSQ-301]を用いる場合は、反応溶液を20%まで持ち込みことが可能です。


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関連商品

●リアルタイムPCR用cDNA合成キット

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
ReverTra Ace qPCR RT Kit FSQ-101 200回用
(10μl反応)
¥38,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix FSQ-201 200回用
(10μl反応)
¥38,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover FSQ-301 200回用
(10μl反応)
¥40,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。