融解曲線解析によるマルチプレックスPCR解析などに最適。

高効率リアルタイムPCR Master Mix KOD SYBR® qPCR Mix

価格表

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
QKD-201 1.67ml×3本 ¥32,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
QKD-201T 1ml×1本 ¥9,800 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
QKD-201X5 (1.67ml×3本)×5 ¥147,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

KOD SYBR® qPCR / RT Set

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
KOD SYBR qPCR/RT Set QKD201/FSQ101 QKD-201とFSQ-101のセット ¥65,800 -20℃ 該当無し
KOD SYBR qPCR/RT Set II QKD201/FSQ201 QKD-201とFSQ-201のセット ¥65,800 -20℃ 該当無し
KOD SYBR qPCR/RT Set III QKD201/FSQ301 QKD-201とFSQ-301のセット ¥67,800 -20℃ 該当無し

用途

●リアルタイムPCR

説明

KOD SYBR® qPCR Mixは、SYBR® Green I検出系によるリアルタイムPCR用 2×濃度のマスターミックス試薬です。本試薬は、ROX(別添)とプライマー以外の成分があらかじめ混合されています。そのため、反応液調製を簡便化できるとともに、サンプル間の蛍光強度のばらつきを最小限に抑えられ、再現性の高い結果を得ることができます。
本製品は、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性(校正活性)を除去したKOD exo(-) DNA polymeraseと最適化されたバッファー組成を組み合わせることで、KODの優れた合成能やクルード成分の阻害を受けにくいという性質をSYBR® Green Iを用いるインターカレーションアッセイにおいて最大限に発揮させることを可能としました。

特長

● 増幅困難なターゲットに対応

KOD DNA polymeraseを使用することで、Taq DNA polymeraseを用いる従来品では困難であったGCリッチなターゲット、塩基に偏りがあるような配列やプロモーター近傍の2次構造をとりやすいようなターゲットにおいても、定量的な増幅が認められます。(実施例1)
 

●長鎖ターゲット(~2kb)に対応

KOD FXやKOD -Plus- シリーズなどの通常のPCR用に設計したプライマーをそのままご使用頂けます。長鎖ターゲットでも増幅できるためプライマーの選択幅を格段に広げることができます。


2kbまでのさまざまなターゲット長を選択できるため、幅広い融解曲線解析が可能です。プライマーダイマーの発生領域(短鎖領域)を外して増幅領域を選べるため、エンドポイントアッセイでの多型解析、マルチプレックスPCR解析などに有利です。(実施例2)
 

●クルードサンプルを用いる解析が可能

植物ライセート、マウステールアルカリ熱抽出液、血液などのクルードサンプルを用いて直接検出することができます。SYBR® GreenⅠアッセイを応用することで、煩雑だった多型解析やSNP解析を簡便化することができます。(実施例3, 実施例4, 実施例5 )
 

●高い特異性

プライマーダイマーなどの非特異反応を抑えることで、低コピー域までの幅広い定量が可能です。また、弊社リアルタイムPCR用cDNA合成キット「ReverTra Ace® qPCR RTシリーズ」を併用することで安定した検出を得ることができます。(実施例6)
 

●さまざまな機器に対応

ブロックタイプの機器(Fast Modeにも対応)のほか、ガラスキャピラリーを用いる高速サイクラーにも対応しています。また50X ROX reference dyeが別添付されているため、パッシブリファレンスを必要とする機器においても各機器に適したROX濃度でご使用になれます。


【対応可能機器例】


機 器 ROX 最終濃度
(添加量)
 Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、
 StepOnePlus™

(1/50量)
 Applied Biosystems 7500、7500Fast、 ViiA、QuantaStudio、Agilent
 Technologies Mx3000P、Mx3005P、Mx4000
0.1×
(1/500量)
 Roche Diagnostics LightCycler® 2.0、LightCycler® Nano、 Bio-Rad
 MiniOpticon™、CFX96 Touch™、 BioFlux Line Gene
不要

実施例

1.増幅困難なターゲットの検出

●GCリッチなターゲット
GC含量が70%を超えるターゲットに対し、各リアルタイムPCR試薬による反応性の比較を行いました。鋳型には、弊社の高性能逆転写反応用試薬「ReverTra Ace® qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101]」により合成したHeLa細胞total RNA由来のcDNAを用い、cDNAの5倍希釈(5段階)について、反応を実施しました。その結果、弊社従来品では、増幅困難であったGC-richなターゲットに対しても、定量的な増幅が認められました。また、反応特異性が高く、プライマーダイマーが生じにくいため、低コピーまでの幅広い定量可能域を得ることができました。



図1. GCリッチなターゲットに対するリアルタイムPCR(ABI StepOnePlusTM 使用)

●GC含量に偏りがあるターゲット
ヒトゲノムをテンプレートとして、配列中の赤字で示した部分をPrimer配列として使用し、解析を行いました。
その結果、本品では定量的な増幅が認められ、2次構造をとりやすいターゲットにおいても有効であることが確認できました。


図2. GC含量に偏りのあるプロモーター領域に対するリアルタイムPCR(ABI StepOnePlusTM 使用)
 

2.長鎖ターゲットの検出

●2kbターゲットの解析
KOD FXシリーズやKOD-Plus-シリーズで増幅可能なプライマーを用い、約2kbのターゲットの増幅を実施しました。その結果、Taq DNAポリメラーゼを用いる従来品では増幅困難な約2kbのターゲットでも本品では定量的な増幅が認められました。

図1. 長鎖ターゲットに対するリアルタイムPCR(ABI StepOnePlusTM使用)
 


●増幅長が異なるターゲットの解析
ヒトゲノムDNAを鋳型にβ-アクチン遺伝子上の増幅長が異なるターゲットの増幅、及び融解曲線解析を実施しました。その結果、60bp~約1kbまでの増幅産物が得られ、74~87℃の幅広い温度域で今回増幅した増幅産物の識別が可能でした。そのため、増幅長を変え融解温度に差異が生じるようにプライマーを設計することでワンチューブで複数のターゲットの検出が可能となります。この融解曲線の差異はGC含量に左右されますが、増幅産物のTm値を計算することで予測可能です。


図2. 増幅長が異なるターゲットを用いた解析(ABI7500使用)
 

3.クルードサンプル(マウステール)の検出

マウステールアルカリ熱抽出液を用いワンチューブでジェノタイピング解析を実施しました。WT特異的増幅産物とknock-in特異的増幅産物の増幅長を変えることで、計算上、増幅産物のTm値に差異が生じるように設計しました。WT特異的プライマーは、CreER knock-inに対しては、増幅長が長いため、伸長時間を30秒と短くすることで増幅できないようにしています。また、ヘテロ検出におけるピーク比のバランスをとるために、WT特異的プライマー:knock-in特異的プライマー=1:3として検出の結果、すべてのタイプで増幅が認められジェノタイピングを実施することができました。


図. 融解曲線解析を用いるワンチューブマウスジェノタイピング(ABI 7500使用)
 

その他の実施例

<クルードサンプルの解析例>
実施例4: ASP(Allele specific primer)-PCRを用いるSNP(Single nucleotide polymorphism)解析
実施例5: 植物葉からの検出
実施例9: クルードサンプル(菌液)を用いたリアルタイムPCR
実施例10: 生物農薬糸状菌の特異的検出及び定量
<増幅が困難なターゲットの成功例>
実施例6: プライマーダイマーが生じやすいターゲットの検出
実施例7: プロモーター近傍配列の増幅
実施例8: ゲノムDNA相対定量 
実施例11: ChIPターゲットの効果的な増幅

参考文献

1) R.M. de Breuil et al., PCR Methods Appl., 3 : 57-59 (1993)
2) P.M. Holland et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88 : 7276-7280 (1991)
 

製品内容

【QKD-201T】
qPCR Mix          1ml×1本
50X ROX reference dye      50μl×1本
(50μl反応で40回用、20μl反応で100回用となります)

【QKD-201】
qPCR Mix                       1.67ml×3本
50X ROX reference dye     250μl×1本
(50μl反応で200回用、20μl反応で500回用となります)

基本反応条件

<インターカレーターアッセイ>
滅菌水  Xμl
qPCR Mix  10μl
Forward Primer  4pmoles
Reverse Primer  4pmoles
50×ROX referencre dye 0.4/0.04μl*
DNAサンプル  Yμl
Total Volume  20μl

*50X ROX reference dyeは、Applied Biosystems社製機器など、ウェル間の蛍光強度および分注誤差補正のためにパッシブリファレンスを用いる機器での反応の際に添加してください。また、補正を行わない機器では添加する必要はありません。


Cycle
98℃,  120sec.
    ↓
98℃,   10sec.
60℃*1,  10sec.
68℃,    30sec./500bp  40 cycles

*1 アニーリング温度は、プライマーの50~68℃の範囲に設定してください。

※伸長時間は、標的配列が500bp以下の場合は30秒で十分に反応が進行しますが、一部の機器では、安定した蛍光測定に30秒より長い時間を必要とする場合があります。増幅曲線のがたつきや、ウェル間の変動が大きい場合には、長めの時間(45~60秒)を設定してください。

備考

LightCycler® は、Idaho Technology Inc.の商標です。
SYBR® は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。
ABI PRISM® は、Applied Biosystems® Inc.の登録商標です。

ワンポイントアドバイス

●保存について
凍結融解の繰り返しは、10回程度では品質に影響がないことが確認されています。

●逆転写反応溶液の持込について
一般的な逆転写反応用試薬などを用いて合成したcDNA液を、精製せずに滅菌水などで適宜希釈して、そのままリアルタイムPCR反応液に添加してご使用いただくことができます。
添加量は反応液量の10%を上限の目安としてください。ReverTra Ace® qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101]、ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix [Code No. FSQ-201]、ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover [Code No. FSQ-301]を用いる場合は、反応溶液を20%まで持ち込みことが可能です。


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関連商品

●リアルタイムPCR用cDNA合成キット

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
ReverTra Ace qPCR RT Kit FSQ-101 200回用
(10μl反応)
¥38,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix FSQ-201 200回用
(10μl反応)
¥38,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover FSQ-301 200回用
(10μl反応)
¥40,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

●培養細胞からのcDNA合成キットとのセット品

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
SuperPrep II / KOD SYBR qPCR Set SCQ401/QKD201 SCQ-401とQKD-201のセット ¥99,500 -20℃ 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。