SuperPrep^® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR

SuperPrep^® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR [Code No. SCQ-401] は、リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析のための細胞溶解試薬(Lysis Reagents)と逆転写反応試薬(RT Reagents) からなるキットです。96ウェルプレート等で培養した細胞から、逆転写反応の鋳型として利用可能なRNA を含む細胞ライセートを簡便に調製することができます。さらに、本キットに含まれる逆転写反応試薬は、この細胞ライセートからの逆転写反応に最適化されています。
前バージョンでは Lysis Solution の後に Stop Solution を添加する必要がありましたが SuperPrep^® II では Lysis Solution での処理の後に、そのまま cDNA 合成ステップに移行することができます。また、より幅広い哺乳類細胞から高感度検出が可能になりました。本キットにより、簡便、迅速に培養細胞からリアルタイム PCR 用の鋳型 cDNA の合成が可能です。
弊社THUNDERBIRD^® Probe qPCR Mix [Code No. QPS-101] 、KOD SYBR™ qPCR Mix [Code No. QKD-201] 等と組み合わせて用いることによって、培養細胞から簡便かつ高精度の遺伝子発現解析が可能であることを確認しています。
SuperPrep^®ⅡCell Lysis Kit for qPCR [Code No. SCQ-501] は、細胞溶解試薬 (Lysis Reagents) の別売品です。弊社の RNA-direct ^® Realtime PCR Master Mix [Code No. QRT-101, QRT-201], THUNDERBIRD^® Probe One-step qRT-PCR Kit [Code No. QRZ-101]等の1-step リアルタイムPCR 試薬を用いる解析(簡易測定)にもご使用になれます。

●RNA精製不要
培養細胞から逆転写反応の鋳型として利用可能なRNA を含む細胞ライセートを簡便に調製することができます。Lysis Solution で処理したライセートを鋳型として、そのまま逆転写反応を行うことができるため、解析時間を大幅に短縮することが可能です。

●ライセートから高品質なcDNAを合成
最適化されたバッファー組成により、RNase等の細胞成分によるRNAの分解を効果的に抑えます(調製したライセート中のRNAは氷上で6時間安定です)。また、gDNA Remover (DNaseⅠ)処理後にcDNA合成を行うことから、ゲノムDNAのコンタミの少ない高品質なcDNAを合成することができます。
逆転写試薬は弊社の高効率逆転写酵素「ReverTra Ace^®」をもとに最適化されたマスターミックス※となっており、簡便・高効率にcDNA合成を行うことができます。合成したcDNAは長期保存可能です。
※マスターミックスにはランダムプライマーとOligo dTプライマーが最適比率で混合されています。

●幅広い哺乳類細胞を用いることが可能
SuperPrep^® II では、細胞の溶解性を向上させると共にRNase の影響を低減することで、前バージョンに比べてより幅広い種類の細胞を用いるアッセイに使用可能です。下表の代表的な細胞について適用できることを確認しています。

●ハイスループット解析のバラツキ低減
プロトコールから少量の分注工程や希釈工程を減らすことで、ハイスループット解析におけるバラツキを低減しました。また、細胞溶解時のピペッティング操作を無くし、gDNA Remover 処理を並行して行うことで操作性を向上させました。反応停止液の添加や、RNAを不安定化する加熱工程などは不要です。

●さまざまなqPCR試薬と組み合わせて使用可能
さまざまなリアルタイムPCR試薬(SYBR™ GreenⅠ、TaqMan^®アッセイ両方に対応可能)と組み合わせて使用可能です。

1.精製RNA と細胞ライセートでのCt の相関の検証

SuperPrep^® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR  を用いて、HUVEC (ヒト臍帯静脈内皮細胞) 2.5x10⁴ cells から細胞ライセートを調製した後、cDNA 合成(40μL 反応系) を行いました。また同時に、HUVEC から抽出したTotal RNA66.6ng からReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix [Code No. FSQ-201] を用いてcDNA合成(40μL 反応系) を行いました。それぞれのcDNA を鋳型にTHUNDERBIRD^® SYBR™ qPCR Mix [Code No. QPS-201]を用いて15 種類のHouse Keeping Gene についてリアルタイムPCR 解析を行い比較しました。
その結果、今回解析した15 種類の遺伝子において、精製RNA と細胞ライセートを用いた解析に良好な相関が認められました。

2.細胞ライセートの氷上安定性の確認

SuperPrep^® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR を用いて、HeLa S3 細胞4x10⁴ cells から細胞ライセートを調製し、氷上に移した後、0 ～ 6 時間後に細胞ライセートをサンプリングし、すぐにcDNA 合成を行いました。同様に弊社従来品(SuperPrep^®) [Code No. SCQ-101]及びA社試薬を用いて細胞ライセートを調製し、同様にサンプリングして、cDNA 合成を行いました。このcDNA を鋳型にTHUNDERBIRD^® Probe qPCR Mix [Code No. QPS-101] を用いて、GAPDH 遺伝子の発現量をリアルタイムPCR を行って解析しました。
その結果、HeLa S3 細胞において氷上に6 時間放置しても顕著なCt 値の遅れは認められませんでした。

実施例3 : バラツキを考慮したアッセイ精度の評価

実施例4 : 種々のqPCR 試薬との組み合わせによる性能比較

<製品使用文献>
K. Katsuya et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 509: 700-706 (2019)
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.12.164