1-step qRT-PCR Kit

RNA-direct ® Realtime PCR Master Mix
シリーズ

TOYOBO

価格表 用途 説明 特長 原理 実施例 参考文献 関連製品

価格表

RNA-direct ® Realtime PCR Master Mix

Code No. 包装 価格(税別) 保存温度 説明書
仕様書		 SDS 法規制※
QRT-101 500μL×5本
(250回用/20μL反応)		 ￥36,000 -20℃ Ｍ Ｓ なし
QRT-101X5 (500μL×5本)×5
(250回用/20μL反応)×5		 ￥164,000 -20℃ Ｍ Ｓ なし

RNA-direct ® Realtime PCR Master Mix -ROX Free-

Code No. 包装 価格(税別) 保存温度 説明書
仕様書		 SDS 法規制※
QRT-101RF 1.25mL×2本
(250回用/20μL反応)		 ￥36,000 -20℃ Ｍ Ｓ なし

RNA-direct ® SYBR™ Green Realtime PCR Master Mix

Code No. 包装 価格(税別) 保存温度 説明書
仕様書		 SDS 法規制※
QRT-201 500μL×5本
(250回用/20μL反応)		 ￥36,000 -20℃ Ｍ Ｓ なし
QRT-201X5 (500μL×5本)×5
(250回用/20μL反応)×5		 ￥164,000 -20℃ Ｍ Ｓ なし

用途

●リアルタイムRT-PCR

説明

Tth DNA polymeraseは好熱細菌:Thermus thermophilusから分離されたpolI型DNApolymeraseです。Mn2+存在下で、逆転写活性を示すユニークな酵素であり、本酵素を用いることで同一チューブ内でcDNA合成反応とPCRを連続的に行うことができます。本試薬は、その特性を利用した「1酵素・1-step系」のリアルタイムPCR試薬であり、RTaseとTaq DNA polymeraseを同一反応系で用いる「2酵素・1-sep」系の試薬に比べ、単一酵素で反応を行うため至適条件の設定が容易であり、より高効率に解析を行うことができます。

特長

●1-stepでハイスループット
RNAを鋳型としてシングルチューブで高効率なリアルタイムPCR解析ができるため、迅速性を必要とする多検体解析に適しています。

●高い特異性
非特異反応を抑えるために、中和抗体によるホットスタート法を採用しています。

●さまざまな用途に応用
プローブアッセイやSYBR™ Green I アッセイなどに対応します。

●タイプの異なる機器に対応
さまざまなリアルタイムPCR装置に幅広く適合しています。


Probe版　 SYBR版
機種別プロトコールはこちら 機種別プロトコールはこちら

●補正が必要な測定機器に対応 [Code No. QRT-101, 201]
パッシブリファレンスを含有していますので、補正が必要な測定機器(Applied Biosystems® StepOnePlus™ など)に対応します。

●ROX標識したプローブの検出に対応 [Code No. QRT-101RF]
パッシブリファレンスのROXが含まれませんので、ROX標識したプローブを用いた検出にも使用でき、マルチプレックスPCR等にもご利用になれます。

●立体構造を形成しやすいRNAやGC-richなターゲットにも対応
ガラスキャピラリーを用いるタイプの測定機器(Roche Diagnostics社のLightCycler® など)にも対応します。逆転写反応を高温で実施するため、立体構造を形成しやすい鋳型RNAの反応にも適しています。更に、Tth DNA polymeraseはGC-richな配列の増幅に有効であることが知られており、GC-richなターゲットの検出にも有効です。

原理

実施例

1. TaqMan® プローブアッセイにおける性能比較

RNA-direct ® VS 2酵素・1-step(装置:BioFlux社 Line Gene使用)

mRNAを鋳型とした、Taq+RTase混合型であるA社試薬(2酵素1-step系)と比較実験を行いました。

ヒト培養細胞由来mRNA(10n倍希釈系列(n=2))を鋳型とし、TaqMan® プローブアッセイによるβアクチンmRNAの検出を行いました(100希釈の反応液20μLに5ngのPoly(A)+ RNAが含まれるように希釈)。

その結果、RNA-direct ® Realtime PCR Master Mixによる反応では、A社試薬推奨の反応条件においても、立ち上がりの早さと直線性において優れた結果を示しました。
 

2. SYBR™ Greenアッセイおける直線性検討

RNA-direct ®> VS 2酵素・1-step(装置:ABI 社 PRISM® 7900HT使用)

HeLa細胞由来のTotal RNA(10n倍希釈系列(n=2))を鋳型とし、SYBR™ GreenアッセイによるβアクチンmRNAの検出を行いました(100希釈の反応液20μLに75ngのTotal RNAが含まれるように希釈)。
その結果、Taq+RTase混合型であるB社キットと比較して、RNA-direct ® SYBR™ Green Realtime PCR Master Mixによる反応では、少なくとも7オーダーの希釈系列において、高い相関性を示しました。

3. SYBR™ Greenアッセイにおける性能比較

RNA-direct ® VS 1酵素・1-step(装置:Roche社 LightCyclerTM 使用)

ヒト培養細胞由来Poly(A)+RNA(10n倍希釈系列(n=2))を鋳型とし、SYBR™ GreenアッセイによりG3PDH mRNAの検出を行いました(100希釈の反応液20μLに5ngのPoly(A)+ RNAが含まれるように希釈)。
その結果、同じくTth DNA Polymeraseを使用したC社試薬と比較して、RNA-direct ® SYBR™ Green Realtime PCR Master Mixによる検出では、立ち上がりの早さ、シグナルの強度、及び検出感度において大きく上回る性能を示しました。

 


実施例4 : 1-step Realtime PCRによるプロテインキナーゼ発現定量
実施例5 : TaqMan® プローブアッセイにおけるマルチプレックス性能比較

参考文献

T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)


リアルタイムPCR試薬選択ガイド

製品内容
【QRT-101,QRT-201】
Master Mix   
50mM Mn(OAc)2  


500μL×5本
 500μL×1本
【QRT-101RF】
Master Mix   
50mM Mn(OAc)2  
1.25mL×2本
 500μL×1本
(50μL反応で100回用、20μL反応で250回用
となります)
基本反応条件
<反応液一例>
RNase free water
Master Mix
50mM Mn(OAc)2
各Primer 
RNAサンプル

(TaqMan® probe)*1
(50×Referense dye)*2
Total Volume
XμL
10μL
1μL
10pmoles each
Total RNA<1μg
mRNA<200ngなど
(4pmoles)
(0.4/0.04μL)
20μL

*1 QRT-101, QRT-101RFの場合
*2 QRT-101RF をROXによる補正が必要な装置
    で使用する場合

<Cycle例>
( QRT-201:Applied Biosystems® 7900HT Standardモードの場合)
90℃, 30sec.
61℃ 20min.
  ↓
95℃ 60sec.
  ↓
95℃ 15sec.
55～65℃ 15sec. 45cycles
74℃ 45sec.
※アニーリング温度は、プライマーのTmなどを考えて、55～65℃の間で調整します。

(QRT-101RF)
90℃, 30sec.
60℃ 20min.
  ↓
95℃ 5sec.
55～65℃ 15sec. 45cycles

ワンポイントアドバイス

●保存について
長期保存の場合は−20℃(遮光)保存をお勧めしますが、短期間に連続使用する場合、3週間程度であれば4℃(遮光)保存可能です。

●逆転写反応時のプライマーについて
PCR用のReverse Primerがそのまま逆転写用のプライマーとなります。
別途添加する必要はありません。また、Oligo dTやRandom Primerは使用できません。

●サンプル添加量について
10μLなどの少量で反応させる場合は、サンプル添加量を1μLなどの極少量にせず、希釈して2μl程度添加することにより、ピペット誤差が抑えられ良好な結果を得ることができます。

●パッシブリファレンス色素に関して
【QRT-101、QRT-201】
あらかじめ混合されています。プレートタイプのPCR機器にそのままご使用になれます。パッシブリファレンス色素を使用しないPCR機器への影響もありません。
【QRT-101RF】
含まれておりません。Applied Biosystems®機器やアジレント社製機器などでウェル間の蛍光強度および分注誤差補正のためパッシブリファレンスを使用する場合は、別売品である50×ROX reference dye[Code No. ROX-101]をお使いください。

●マンガン溶液に関して
RNA-direct ® Realtime PCRシリーズには、必要量の酢酸マンガン溶液が別チューブ(オレンジのラベル)で添付されています。

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English Page

※ 法規制について
毒： 毒物及び劇物取締法[医薬用外毒物]
国： 国民保護法[毒素]
劇： 毒物及び劇物取締法[医薬用外劇物]
組： カルタヘナ法(遺伝子組換え生物等の使用等の規制による
危： 消防法[危険物]
　　 生物の多様性の確保に関する法律）
Ｐ： PRTR法（化学物質排出把握管理促進法）[届け出義務物質]
申： ご購入時に申込書の提出が必要な製品
労： 労働安全衛生法[通知または表示義務物質]
なし： 上記法令や申込書の提出に該当しない製品

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