KODシリーズの原点となったPCR酵素。正確性はTaqの約50倍、伸長速度はTaqの約2倍。

高正確性PCR酵素 KOD DNA Polymease

価格表

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
KOD-101 250U×1本 ¥28,000 -20℃ 取扱説明書 データシート SDS 該当無し
KOD-101X5 (250U×1本)×5 ¥112,000 -20℃ 取扱説明書 データシート SDS 該当無し

用途

●PCR
●DNAフラグメントの平滑化

 

説明

本酵素は、鹿児島県小宝島の硫気孔から今中先生らにより単離された超好熱始原菌Thermococcus kodakarensis KOD 1株由来のDNA polymeraseで、KOD -Plus-やKOD FXなどの増幅効率を向上させた高正確性PCR酵素の元となった酵素です。
強い3'→5'Exonuclease活性(校正活性)を有し、Taq DNA polymeraseに比べ約50倍の高い正確性を示します。
また、2.5U/反応で至適化されており、短いターゲットを正確に短時間(30sec./kb)で増幅することができます。
一方、KOD -Plus-やKODFXでは長距離性能や成功率を向上させるため1U/反応で至適化されているため、伸長時間はTaqと同じ1min./kbに設定されています。(反応性を改善したKOD -Plus- NeoやKOD FX Neoでは、30sec./kbの反応も可能です。)
 

特長

●優れた正確性
強い3'→5'Exonuclease活性を有するため、Taq DNA Polymeraseに比べ、PCRにおいて約50倍の正確性を示し、PCR産物のクローニング目的に適しています。

●速いDNA合成速度
Taq DNA Polymeraseの約2倍、Pfu DNA Polymeraseの約6倍の合成速度を示し、高速PCRに用いることができます。

●優れた耐熱性
Taq DNA Polymeraseよりも耐熱性に優れ、100℃・1時間の熱処理後も約70%の活性を維持しています。
そのため熱変性ステップの温度を高く設定でき、GC-richな鋳型など特異的高次構造をとるようなターゲットに有利です。
 


 

実施例

1. 各DNAポリメラーゼのPCR伸長反応速度の比較

 M13mp18 ssDNAを鋳型にP7プライマーを用いて75℃において伸長反応を行った後、アルカリ変性アガロース電気泳動を行い、オートラジオグラフィーにて検出しました。
反応は、鋳型を1.6μg、酵素5Uを使用し、[α-32P]dCTPを含んだ80μlの系で行いました。
その結果、KOD DNA polymeraseは他の酵素に比べて反応速度が速く、Taq DNA Polymeraseの約2倍、他社のα型PCR用酵素とでは約4~6倍の合成速度を保持していることが分かりました。


 

2. KOD DNA PolymeraseのPCRにおける鋳型量の比較

プラスミドを10pg~100ng用い、50μlの系で酵素を2.5U使用して1kbのターゲットの増幅を行いました。
その結果、100pg~100ngまでの幅広い鋳型量で良好な増幅を確認できました。


 

3. KOD DNA PolymeraseのPCRにおける伸長反応時間の比較

λDNA上の2kbをターゲットにして、KOD DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase及びA社高正確性PCR酵素を用い、増幅効率を比較しました。
反応はプラスミド2ng、酵素2.5Uを使用し、50μlの系で行いました。
その結果、KOD DNA Polymeraseは、伸長時間が1sec.の場合においても増幅が認められ、5sec.で良好な結果が得られました。一方、Taq DNA PolymeraseとA社酵素では、良好な結果が得られるには、10sec.と60sec.の伸長時間が必要でした。


 

参考文献

1) Imanaka T. et al., Appli Environ. Microbiol, 63: 4504-4510 (1997)
2) Thomas A. Kunkel. J. Biol. Chem., 260: 5787-5796 (1985)
3) Imanaka T. et al., J. Biochem. (Tokyo), 125: 983-986 (1999)
4) Imanaka T. et al., J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
5) Ohki Y. et al., J. Biochem. (Tokyo), 132: 713-718 (2002)
6) Okuno K.. et al., Biotchnol. Appi. Biochem., 36: 77-84 (2002)
7) Karaya K.. et al., J. Biochem. (Tokyo), 129: 769-775 (2001)
 

製品内容

KOD DNA Polymerase(2.5U/μl) 100μl×1本
10×Buffer #1 [KOD-1B1] 1ml×1本
10×Buffer #2 [KOD-1B2] 1ml×1本
25mM MgCl2 [TAP-2S] 1ml×1本
2mM dNTPs* [NTP-201] 1ml×1本

*本酵素によるPCRは、dNTPs[NTP-201]をお使いください。他のdNTPsでは、充分な性能を得られない場合があります。

※50μlで反応を行なった場合、100~200回用としてご使用いただけます。
 

形状:
50mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA
50mM KCl
1mM DTT
0.1% Tween® 20
0.1% Nonidet® P-40
50% Glycerol

Buffer組成:
10×Buffer #1 [KOD-1B1]
1.2M Tris-HCl(pH8.0)
100mM KCl
60mM (NH4)2SO4
1% Triton® X-100
100μg/ml BSA

10×Buffer #2 [KOD-1B2]
1.2M Tris-HCl(pH8.8)
100mM KCl
60mM (NH4)2SO4
1% Triton® X-100
100μg/ml BSA

活性の定義:
75℃ 活性測定条件で30分間に10nmolesの全ヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量を1Uとします。

起源:
E.coli 組換体

ワンポイントアドバイス

●PCR産物のクローニング
本酵素のPCR産物は平滑化されているため、平滑末端クローニング法によってクローニングできます。
その際ベクター側を脱リン酸化処理している場合、PCR産物のリン酸化を行うか、5'リン酸基のついたプライマーを使用する必要があります。
また、本酵素のPCR産物は平滑化されているため、直接TAクローニングすることはできません。
専用のTAクローニングキット「TArget Clone -Plus-」を用いると簡便・高効率にTAクローニングが可能です。

●PCR条件の設定について
伸長反応は、ターゲット1kbに対して30sec.を標準とします。過剰の伸長反応は、PCR産物のスメアリングを招く場合があります。スメアリングが認められる場合は、伸長反応の時間を短くするか酵素量を減らして検討します。
本酵素は耐熱性が高いため、GC-richな鋳型等、高次構造を取りやすい鋳型の場合には、変性反応を96℃以上で行うことができます。

●プライマーの設計
本酵素は、3'→5'Exonuclease活性を有するため、プライマーはTaq DNA Polymeraseの場合に比べ、長めの設定を行うことをお薦めします。また、Tm値が高いプライマーを使用する場合は2ステップPCRが可能です。
また、3'側にミスマッチのあるプライマーは、本酵素によって修正を受ける場合があります。

●添付バッファーについて
本酵素には、2種のバッファーが添付されています。通常は#1を使用しますが、ターゲット長が4kb以上の場合や、#1でスメアリングが生じた場合は、#2の使用をお薦めします。

●Long PCR
本酵素は、Long PCR用ではありません。長いターゲットを正確に増幅したい場合は、KOD -Plus- / KOD -Plus- Ver.2もしくはKOD FXをお薦めします。

FAQはこちら

関連商品

(別売りパーツ)

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
KOD DNA Polymerase用 Buffer 1 (10×) KOD-1B1 1ml ¥1,000 -20℃ SDS 該当無し
KOD DNA Polymerase用 Buffer 2 (10×) KOD-1B2 1ml ¥1,000 -20℃ SDS 該当無し
rTaq DNA Polymerase / KOD DNA Polymerase用 25mM MgCl2 TAP-2S 1ml ¥1,000 -20℃ 該当無し
dNTPs Mixture(2mM) NTP-201 1.0ml ¥8,000 -20℃ データシート 該当無し

●高効率・高正確性PCR酵素

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
KOD -Plus- Neo KOD-401 200U×1本 ¥30,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
KOD FX Neo KFX-201 200U×1本(200回用) ¥35,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

●KODシリーズ用高効率TAクローニングキット

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
TArget Clone -Plus- TAK-201 10回用 ¥16,000 -20℃ 取扱説明書 該当無し

●高効率DNAフラグメント抽出キット

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
MagExtractor -PCR & Gel Clean up- NPK-601 200回用 ¥28,000 室温 取扱説明書 SDS 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。