サイクル後半での増幅の鈍化を改善。伸長時間短縮で理想的なクローニング用PCRを実現。

高正確・高効率・高速PCR酵素 KOD -Plus- Neo

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価格表

Code No. 包装 価格 キャンペーン価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
KOD-401 200U×1本 ¥30,000 ¥18,000 -20℃ 取扱説明書 データシート データシート(外部サイト) SDS 該当無し
KOD-401X5 (200U×1本)×5 ¥120,000 ¥84,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
KOD-401X10 (200U×1本)×10 ¥210,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

用途

● PCR

説明

KOD -Plus- Neoは、高正確性PCR酵素KOD -Plus-シリーズの技術に新たに開発した「伸長エンハンサー」を応用することで、高い正確性(Taq DNA polymeraseの約80倍)を保持しつつ、微量な鋳型DNAからの増幅や長いターゲットの増幅効率を格段に向上させた酵素です。

特長

●微量な鋳型DNAから正確・高効率な増幅が可能
伸長エンハンサー技術を応用することによって、微量な鋳型DNAからでも高正確・高効率に目的遺伝子を増幅することができるようになりました。本酵素は高い正確性(Taqの約80倍)を示し、低コピー数の鋳型からも正確に目的遺伝子を増幅することができます。

* PCRエラー率は、各酵素にてヒトゲノムDNAを鋳型にβ-globin遺伝子(2.4kb)の増幅を行い、PCR産物をTAクローニング後、96クローンをシーケンシング解析し、測定しました。

●ホットスタートでPCRパフォーマンス向上
2種類の抗KOD抗体を酵素に混合することによって、非特異反応の原因となる常温下でのPolymerase活性と3'→5'Exonuclease活性を抑制しています。抗体はPCRの最初の変性ステップで失活し、増幅反応には影響を及ぼしません。

●伸長時間を短縮<30sec./kb>(長いターゲットでより便利になりました)
伸長時間を、従来品の60sec./kbから30sec./kbに短縮。長いターゲットでより便利になりました。



●長鎖ターゲットの増幅
従来品より伸長性が向上し、様々な長さのターゲットを増幅できます。ゲノムDNAで24kbまでの増幅を確認しています。

●さまざまなプライマーで同一温度サイクル条件を実現
20mer以上のプライマー(Tm値>63℃)においては、まずは2ステップサイクルをお試しください。サイクル条件の検討は不要です。(基本反応条件ご参照)

*Tm値は、最近接塩基対法(Nearest Neighbor Method)を用いて計算した値を利用しています。


 

原理

KOD DNA polymeraseは、強い3‘→5’エキソヌクレアーゼ活性(校正活性)を有し、正確にターゲット配列を増幅することができるため、クローニング用のPCR酵素として好評いただいております。
しかし、高正確性PCR酵素は、20~30サイクル以降、増幅が持続しなくなる<プラトー現象>が出やすいと言われています。

KOD –Plus-Neoは、高正確性PCR酵素KOD -Plus-シリーズの技術に、弊社で新たに開発した「伸長エンハンサー」を応用することでTaqの約80倍というKOD -Plus-シリーズの高い正確性を保持しつつ、<プラトー現象>を抑えることにより、微量な鋳型DNAからの増幅や長いターゲットの増幅効率を格段に向上させることに成功しました。

実施例

1.Total RNA からの全長ORFの増幅

HeLa cell由来Total RNA 1μgから合成したcDNA約50ngを使用して、さまざまなプロテインキナーゼのORF(open reading frame)の全長を増幅しました。
サイクルは各酵素の最適条件にて、30サイクル行いました。
その結果、KOD -Plus- Neoで増幅した場合にのみ、すべての遺伝子で明瞭な増幅産物を得ることができ、すべてのORFを迅速にクローニングすることが可能でした。


 

2. β-globin遺伝子上の各領域における増幅効率・伸長性の比較

Human genomic DNA 50ngを用いてさまざまなサイズのβ-globin遺伝子の増幅を行いました。
反応はそれぞれのPCR酵素の推奨条件に従って、同じサイクル数にて実施しました。
その結果、KOD -Plus- Neoを用いた場合でのみ、17.5kbまでの明瞭な増幅を確認することができました。
また、17.5kb以下の増幅においても、他社PCR酵素を大幅に上回る収量が認められました。


 

3. 長鎖ターゲットの増幅

ヒトゲノムDNA(200 ng)をテンプレートに様々なプライマー濃度でβ-globin遺伝子(17.5 kb)、tPA(Human tissue-type plasminogen activator)遺伝子(24.0 kb)の増幅を行いました。その結果、長鎖ターゲットの増幅では、プライマー濃度を下げることで増幅量が増すことが示されました。

このように10 kb以上の長鎖ターゲットを増幅する場合は、プライマー濃度を0.15μM(終濃度)でご利用ください。増幅量が向上する場合があります。

参考文献

1) M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63 : 4504-4510 (1997)
2) H. Hashimoto et al., J. Biochem.(Tokyo), 125 : 983-986 (1999)
3) H. Mizuguchi et al., J. Biochem.(Tokyo), 126 : 762-768 (1999)
4) M. Nishioka et al., J. Biotechnol., 88 : 141-149 (2001)
5) H. Hashimoto et al., J. Mol. Biol., 306 : 469-77 (2001)
6) T. Imanaka et al., J. Chin. Inst.Chem. Engrs., 32 : 277-288 (2001)
 

製品内容

KOD -Plus- Neo (1U/μl)    200μl×1本
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo [KOD-4B]                   1ml×1本
25mM MgSO4 [KOD-2S]       1ml×1本
2mM dNTP [NTP-201]         1ml×1本

※50μlで反応を行なった場合、200回用としてご使用になれます。
 

形状:
50mM Tris-HCl (pH8.0)
25mM KCI
0.1mM EDTA
1mM DTT
0.05% Tween® -20
0.05% Nonidet® P-40
50% Glycerol

活性の定義:
75℃活性測定条件で30分間に10nmolesの全ヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量を1Uとします。

起源:
E.coli 組換体
 

注意事項

PCRには製品に添付されているdNTPsまたは別売りのdNTPs Mixture (2mM) [NTP-201]をご使用ください。他のdNTPsでは、十分な性能が得られない場合があります。

基本反応条件

滅菌蒸留水X μl
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo  5μl
2mM dNTPs  5μl
25mM MgSO4  3μl
10pmol/μl Primer F  1.5μl
10pmol/μl Primer R  1.5μl
KOD -Plus- Neo (1.0U/μl)  1μl
Genomic DNA  ~200ng
Plasmid DNA  ~50ng
cDNA  ~200ng (RNA相当)
Total 50μl

〈2ステップサイクル〉*
94℃ 2min.
    ↓
98℃ 10sec.
68℃ 30sec./kb 25~45 cycles

〈3ステップサイクル〉*
94℃ 2min.
  ↓
98℃ 10sec.
Tm℃ 30sec.
68℃ 30sec./kb 25~45  cycles

〈ステップダウンサイクル〉*
94℃, 2min.
    ↓
98℃, 10sec.
74℃, 30sec./kb 5 cycles
    ↓
98℃, 10sec.
72℃, 30sec./kb 5 cycles
    ↓
98℃, 10sec.
70℃, 30sec./kb 5 cycles
  ↓
98℃, 10sec.
68℃, 30sec./kb 15~30 cycles
    ↓
68℃, 7min.

*プライマーのTm値が63℃より高い場合は、2ステップサイクルで行います。
Tm値が63℃以下および2ステップで増幅が見られない場合は、3ステップサイクルをお試しください。
増幅産物にエキストラバンドやスメアが見られた場合は、ステップダウンサイクルをお試しください。

プライマーのTm値の計算は、最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いております。プライマーのTm値計算表(EXCEL)は、こちらからダウンロードいただけます。

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ワンポイントアドバイス

●PCR産物のクローニング
本酵素のPCR産物は平滑化されており、平滑末端クローニング法によってクローニングできます。
その際ベクター側を脱リン酸化処理している場合、PCR産物のリン酸化を行うか、5'リン酸基のついたプライマーを使用する必要があります。
また、本酵素のPCR産物は平滑化されているため、直接TAクローニングすることはできません。
専用のTAクローニングキット「TArget CloneTM-Plus-」をご使用ください。

●PCR条件の設定について
酵素の標準使用量は、50μlの系に対して1Uとしてください。
伸長反応は、68℃で行い、ターゲット1kbに対して1min.を標準とします。スメアリングが起こっている場合はMgSO4の濃度を下げ、増幅が見られない場合はMgSO4濃度を上げて検討します。

●GC-richな鋳型の場合
反応液にDMSOを最終濃度2〜5%程度添加することにより、改善される場合があります。

●RT反応液を鋳型とする場合
RT反応液の大量の持ち込みは、本酵素によるPCR反応を阻害する場合があります。
RT反応液のPCRへの持ち込みは、PCR反応液の1/25以下(好ましくは1/50以下)をお薦めします。
この場合、RT反応液からのMg2+やdNTPsの持ち込みについては考慮する必要はなく、基本反応条件に沿って、本酵素の添付のdNTPsとMgSO4を添加していただければ問題ありません。

●プライマーの設計
3'側にミスマッチのあるプライマーは、本酵素によって校正を受ける場合があります。

FAQはこちら →

関連商品

(別売りパーツ)

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo KOD-4B 1.0mlX1本 ¥1,000 -20℃ 該当無し
25mM MgSO4 KOD-2S 1ml ¥1,000 -20℃ 該当無し
dNTPs Mixture(2mM) NTP-201 1ml ¥8,000 -20℃ データシート 該当無し

●KODシリーズ用高効率TAクローニングキット

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
TArget Clone -Plus- TAK-201 10回用 ¥16,000 -20℃ 取扱説明書 該当無し

●高効率DNAフラグメント抽出キット

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
MagExtractor -PCR & Gel Clean up- NPK-601 200回用 ¥28,000 室温 取扱説明書 SDS 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。
製品サンプル請求一覧