実施例

KOD One 実施例6 相補的なプライマーを用いる変異導入(Site-Directed Mutagenesis)

<実験の目的>
相補的なプライマーを用いた変異導入法による、約5 kbのプラスミドへ変異導入(3塩基置換、3塩基欠損、3塩基挿入)を実施。

<実験方法>

【サンプルの種類】
プラスミドDNA

【サンプルの調製方法】

組換え大腸菌からミニプレップにて精製しました。

【プライマー設計】
(Fwd : Forward,  Rev : Reverse)

①導入したい変異、位置を決定します。

導入したい変異		プラスミド配列
		5’-ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3
		↓
置換例　ATG→TGC		5’-ATGCATGCATGCATGCATGCATGCTGCCATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3
欠損例　ATGを除去		5’-ATGCATGCATGCATGCATGCATGC……CATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3
挿入例　ATGの前にAAA		5’-ATGCATGCATGCATGCATGCATGCAAAATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3

②Fwd プライマーの設計
変異部位を中心に5‘側、3’側それぞれに12～20 bpのプラスミドにハイブリダイズする領域をつけます。

プラスミド配列
5’-ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3
↓
5’- TGCATGCATGCATGCTGCCATGCATGCATGCAT-3‘	⇒ 置換用Fwd Primer
12～20bp                      　12～20bp
5’- TGCATGCATGCATGC……CATGCATGCATGCAT-3	⇒ 欠損用Fwd Primer
12～20bp                      　12～20bp
5’- TGCATGCATGCATGCAAAATGCATGCATGCATG-3	⇒ 挿入用Fwd Primer
12～20bp                      　12～20bp

 

③Rev プライマーの設計
上記で設計したForwardプライマーと逆相補鎖のプライマーを設計します。

5’- TGCATGCATGCATGCTGCCATGCATGCATGCAT-3 3’- ACGTACGTACGTACGACGGTACGTACGTACGTA-5	⇒ 置換用Rev Primer
5’- TGCATGCATGCATGC……CATGCATGCATGCAT-3 3’- ACGTACGTACGTACG……GTACGTACGTACGTA-5	⇒ 欠損用Rev Primer
5’- TGCATGCATGCATGCAAAATGCATGCATGCATG-3 3’- ACGTACGTACGTACGTTTTACGTACGTACGTAC-5	⇒ 挿入用Rev Primer

【反応液組成】                                                        【PCRサイクル】

		(μL)
	滅菌蒸留水	21		98℃  10sec.
	KOD One® PCR Master Mix	25		60℃    5sec.		15cycles
	10pmol/μL Primer F	1.5		68℃  25sec.
	10pmol/μL Primer R	1.5		(5sec. / kb)
	50ng/μL プラスミド	1
	Total Volume	50

PCR反応液     ↓ ← Dpn I 20Unit   [ Code No. DPN-101 ]     ↓     37℃, 1hr.     ↓   JM109 [ Code No. DNA-900F ]を   形質転換* * 形質転換の際に大腸菌がもつリガーゼ によってニックが修復されますので、 ライゲーションを行う必要はありません。

<結果・考察>
KOD One^® PCR Master Mixを使用することで、5 kbのプラスミドでも伸長時間25 sec.の高速サイクルで変異導入ができました。得られたコロニーのほとんどで変異導入が確認され、目的外変異(2nd- site mutation)は確認されませんでした。 KOD One^® PCR Master Mixを用いることで、迅速かつ正確に変異導入が可能です。

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