(培養細胞・エクソソーム溶解試薬付き) miRNA解析用cDNA合成マスターミックス
miRNAssay® qPCR RT Master Mix
SuperPrep® miRNAssay® Cell Lysis & RT Kit for qPCR
- NEW ITEM
TOYOBO
価格表
miRNAssay® qPCR RT Master Mix
| Code No. | 包装 | 価格(税別) | ｷｬﾝﾍﾟｰﾝ 価格(税別) | 保存温度 | 説明書 仕様書 |
SDS | 法規制※ | MIR-101 | 200回用 | ￥29,000 | ￥17,400 | -20℃ | Ｍ | Ｓ | なし | MIR-101T | 40回用 | ￥8,500 | ― | -20℃ | Ｍ | Ｓ | なし |
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SuperPrep® miRNAssay® Cell Lysis & RT Kit for qPCR
説明
miRNAssay® qPCR RT Master Mix [Code No. MIR-101] は、⾼効率逆転写酵素「ReverTra Ace®」を⽤いて開発されたmiRNA専⽤のリアルタイムPCR⽤逆転写反応試薬です。ステムループRTプライマーを⽤いた逆転写反応に最適化され、特異的かつ⾼感度にmiRNAからcDNAを合成できます。
SuperPrep® miRNAssay® Cell Lysis & RT Kit for qPCR [Code No. MIR-201] は、培養細胞やエクソソームを溶解する試薬とmiRNA専⽤の逆転写試薬からなるキットです。本製品をお使いになることで、培養細胞や回収したエクソソームからRNAを精製することなく、⾼品質なcDNA合成が可能です。
特長
●プレミックスcDNA合成試薬
逆転写試薬をプレミックス化。試薬調製を簡便化するとともに、ばらつきを抑えることで安定的な結果を提供。
●⾼い特異性
ステムループRTプライマーに最適化された組成で、成熟したmiRNAのみを特異的にcDNA化。
●幅広いダイナミックレンジ
低コピーのターゲットから、⾼コピーのターゲットまで、⾼効率かつ特異性⾼く、cDNAを合成可能。
●優れた試薬適合性
さまざまなリアルタイムPCR試薬と組み合わせて使⽤可能。市販のステムループRTプライマーも適⽤可能。
●培養細胞・エクソソームから精製せずにcDNAを合成可能
SuperPrep® miRNAssay®には培養細胞・エクソソーム溶解試薬を内包。RNA精製不要で、培養細胞・エクソソーム中のmiRNAのcDNA化が可能。
原理
本製品は、ループ状の構造を持つRTプライマー (ステムループRTプライマー) を使⽤しmiRNAを逆転写する試薬です。ステムループRTプライマーを使⽤することで、miRNAを効率的に逆転写でき、逆転写と同時にその鎖⻑を伸ばすことができます。
実施例
1. 相同性の高いmiRNAを用いた特異性の確認
Yeast Total RNA 100ngに let-7a、let-7g、miR-98 の合成 RNA 105copyを混合し、miRNAssay® qPCR RT Master Mix と他社試薬でcDNA合成を⾏いました。合成されたcDNAを鋳型にリアルタイムPCRを⾏い、その検出効率を⽐較しました。検出効率は⽬的のmiRNAが 100% であると仮定し、Ct値の差から計算しました。その結果、本製品では相同性の⾼いmiRNAでも、⾼い精度で識別できることが⽰されました。
| 検出ターゲットの配列 Let-7a ︓5ʻ-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3ʼ Let-7g ︓5ʻ-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU-3ʼ miR-98 ︓5ʻ-UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU-3ʼ |
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2. total RNA 10倍 希釈系列(1pg~100ng)からのcDNA合成
miRNAssay® qPCR RT Master Mixとlet-7a特異的なステムループRTプライマーを⽤い、HeLa細胞由来のtotal RNA 10倍希釈系列(1pg~100ng)からcDNA合成を⾏いました。その逆転写溶液 1/10量をリアルタイムPCRに供し、定量性を確認しました。同様に他社逆転写試薬でも let-7aのcDNA合成を⾏い、リアルタイムPCR解析を⾏いました。
その結果、本製品ではRT(-)のコントロールであるno-RT Controlでは増幅シグナルは検出されず、1pg〜100ngまでの幅広い範囲で let-7aの定量的な検出が可能でした。
実施例3 培養細胞ライセートからのmiRNA検出
実施例4 エクソソームライセートからのmiRNA検出
- 製品内容
MIR-101 MIR-101T 5×RT Master Mix 400μL×1本 80μL×1本 5×RT Master Mix no-RT Control 40μL×1本 10μL×1本 Nuclease-free Water 1.1mL×2本 440μL×1本
MIR-201 MIR-201T 5×RT Master Mix 800μL×1本 160μL×1本 5×RT Master Mix no-RT Control 80μL×1本 16μL×1本 Nuclease-free Water 1.7mL×2本 440μL×1本 Lysis Solution 6.5mL×1本 1.3mL×1本 gDNA Remover 33μL×1本 10μL×1本 RNase Inhibitor 110μL×1本 22μL×1本
- 注意事項
*本製品にステムループRTプライマー、及びリアルタイムPCR試薬は添付されていません。リアルタイムPCRには、弊社⾼効率リアルタイムPCR試薬THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mix [Code No. QPX-201]、あるいはTHUNDERBIRD® Next Probe qPCR Mix [Code No. QPX-101] のご使⽤をお勧めします。
- 基本反応条件
【精製RNA】 (cDNA合成) 氷上で以下を調製 5×RT Master Mix 2 μL RTプライマー X μL RNA template Y μL Nuclease-free Water 8-X-Y μL total 10 μL 反応液を軽く撹拌して均一にした後、以下の
温度でインキュベート
16℃, 30min.
42℃, 5min.
95℃, 5min.
4℃, hold
【培養細胞および精製細胞外小胞(エクソソ
ーム)】(細胞溶解) Lysis Solution 58.7 μL RNase Inhibitor 1 μL gDNA Remover 0.3 μL total(A) 60 μL <培養細胞の場合>
細胞数を計測し、遠心して培地を除去
PBS(-)で洗浄
1×107 cells/mL以下になるようにPBS(-)に
懸濁、マイクロチューブに5 μLずつ分注
予め混合しておいた細胞溶解液(A) 60μL を
チューブに加える
室温でボルテックスを10秒かけたのち、5分間
(最大10分まで)インキュベート
70℃で2分間インキュベート
マイクロチューブを氷上に移す
<精製細胞外小胞の場合>
精製細胞外小胞画分5 μLに対して、細胞溶解液
(A)10 μLを加える
室温でピペッティングまたはボルテックスを
行い、5分間(最大10分まで)インキュベート
70℃で2分間インキュベート
マイクロチューブを氷上に移す(cDNA合成) 5×RT Master Mix 8 μL RTプライマー X μL ライセート 8 μL Nuclease-free Water 24-X μL total 40 μL 反応液を軽く撹拌して均一にした後、以下の
温度でインキュベート
16℃, 30min.
42℃, 5min.
95℃, 5min.
4℃, hold
- ※ 法規制について
- 毒： 毒物及び劇物取締法[医薬用外毒物]
- 国： 国民保護法[毒素]
- 劇： 毒物及び劇物取締法[医薬用外劇物]
- 組： カルタヘナ法(遺伝子組換え生物等の使用等の規制による
- 危： 消防法[危険物]
- 生物の多様性の確保に関する法律）
- Ｐ： PRTR法（化学物質排出把握管理促進法）[届け出義務物質]
- 申： ご購入時に申込書の提出が必要な製品
- 労： 労働安全衛生法[通知または表示義務物質]
- なし： 上記法令や申込書の提出に該当しない製品
