miRNAssay™ qPCR RT Master Mix
SuperPrep^® miRNAssay™ Cell Lysis & RT Kit for qPCR

miRNAssay™ qPCR RT Master Mix [Code No. MIR-101] は、⾼効率逆転写酵素「ReverTra Ace^®」を⽤いて開発されたmiRNA専⽤のリアルタイムPCR⽤逆転写反応試薬です。ステムループRTプライマーを⽤いた逆転写反応に最適化され、特異的かつ⾼感度にmiRNAからcDNAを合成できます。
SuperPrep^® miRNAssay™ Cell Lysis & RT Kit for qPCR [Code No. MIR-201] は、培養細胞やエクソソームを溶解する試薬とmiRNA専⽤の逆転写試薬からなるキットです。本製品をお使いになることで、培養細胞や回収したエクソソームからRNAを精製することなく、⾼品質なcDNA合成が可能です。

●プレミックスcDNA合成試薬

逆転写試薬をプレミックス化。試薬調製を簡便化するとともに、ばらつきを抑えることで安定的な結果を提供。

●⾼い特異性

ステムループRTプライマーに最適化された組成で、成熟したmiRNAのみを特異的にcDNA化。

●幅広いダイナミックレンジ

低コピーのターゲットから、⾼コピーのターゲットまで、⾼効率かつ特異性⾼く、cDNAを合成可能。

●優れた試薬適合性

さまざまなリアルタイムPCR試薬と組み合わせて使⽤可能。市販のステムループRTプライマーも適⽤可能。

●培養細胞・エクソソームから精製せずにcDNAを合成可能

SuperPrep^® miRNAssay™には培養細胞・エクソソーム溶解試薬を内包。RNA精製不要で、培養細胞・エクソソーム中のmiRNAのcDNA化が可能。

本製品は、ループ状の構造を持つRTプライマー (ステムループRTプライマー) を使⽤しmiRNAを逆転写する試薬です。ステムループRTプライマーを使⽤することで、miRNAを効率的に逆転写でき、逆転写と同時にその鎖⻑を伸ばすことができます。

1. 相同性の高いmiRNAを用いた特異性の確認

Yeast Total RNA 100ngに let-7a、let-7g、miR-98 の合成 RNA 10⁵copyを混合し、miRNAssay™ qPCR RT Master Mix と他社試薬でcDNA合成を⾏いました。合成されたcDNAを鋳型にリアルタイムPCRを⾏い、その検出効率を⽐較しました。検出効率は⽬的のmiRNAが 100% であると仮定し、Ct値の差から計算しました。その結果、本製品では相同性の⾼いmiRNAでも、⾼い精度で識別できることが⽰されました。
 

検出ターゲットの配列 Let-7a ︓5ʻ-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3ʼ Let-7g ︓5ʻ-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU-3ʼ miR-98 ︓5ʻ-UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU-3ʼ		<miRNAssay™ qPCR RT Master Mix>   miRNA target let-7a let-7g miR-98 Assay let-7a 100.0      0.3      0.3  let-7g    0.0  100.0     0.0  miR-98    0.0     0.0  100.0
		<他社試薬>   miRNA target let-7a let-7g miR-98 Assay let-7a 100.0      6.6      2.1  let-7g    23.3  100.0     0.7  miR-98  189.4     3.1  100.0

 

2. total RNA 10倍 希釈系列(1pg~100ng)からのcDNA合成

miRNAssay™ qPCR RT Master Mixとlet-7a特異的なステムループRTプライマーを⽤い、HeLa細胞由来のtotal RNA 10倍希釈系列(1pg~100ng)からcDNA合成を⾏いました。その逆転写溶液 1/10量をリアルタイムPCRに供し、定量性を確認しました。同様に他社逆転写試薬でも let-7aのcDNA合成を⾏い、リアルタイムPCR解析を⾏いました。
その結果、本製品ではRT(-)のコントロールであるno-RT Controlでは増幅シグナルは検出されず、1pg〜100ngまでの幅広い範囲で let-7aの定量的な検出が可能でした。


 

実施例3 培養細胞ライセートからのmiRNA検出
実施例4 エクソソームライセートからのmiRNA検出