1酵素・1-step系による迅速・高性能なリアルタイムPCR試薬です。

1-step qRT-PCR Kit RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix シリーズ

価格表

RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
QRT-101 500μl×5本(100回用) ¥33,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
QRT-101X5 500μl×25本(500回用) ¥150,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

RNA-direct™ SYBR® Green Realtime PCR Master Mix

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
QRT-201 500μl×5本(100回用) ¥33,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
QRT-201X5 500μl×25本(500回用) ¥150,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

用途

●リアルタイムPCR
 

説明

Tth DNA polymeraseはMn2+存在下で、逆転写活性を示すユニークな酵素であり、本酵素を用いることで同一チューブ内でcDNA合成反応とPCRを連続的に行うことができます。本試薬は、その特性を利用した「1酵素・1-step系」のリアルタイムPCR試薬であり、RTaseとTaq DNA polymeraseを同一反応系で用いる「2酵素・1-sep」系の試薬に比べ、単一酵素で反応を行うため至適条件の設定が容易であり、より高効率に解析を行うことができます。


 

特長

●1-stepでハイスループット
RNAを鋳型としてシングルチューブで高効率なリアルタイムPCR解析ができるため、迅速性を必要とする多検体解析に適しています。
●高い特異性
非特異反応を抑えるために、中和抗体によるホットスタート法を採用しています。
●様々な用途に応用
プローブアッセイやSYBR® Green I アッセイなどに対応します。
●タイプの異なる機器に対応
パッシブリファレンスを含有していますので、補正が必要な測定機器(Applied Biosystems® StepOnePlusTM など)に対応します。
●立体構造を形成しやすいRNAやGC-richなターゲットにも対応
ガラスキャピラリーを用いるタイプの測定機器(Roche Diagnostics社のLightCycler® など)にも対応します。
逆転写反応を高温で実施するため、立体構造を形成しやすい鋳型RNAの反応にも適しています。更に、Tth DNA polymeraseはGC-richな配列の増幅に有効であることが知られており、GC-richなターゲットの検出にも有効です。


 

実施例

1. 『2-step系(RTase+Taq)』との相関性の検討

一般的な2-step法を用いるリアルタイムPCR解析法との相関性を各種ヒト組織由来RNAをサンプルとして、プロテインキナーゼδ(PKCδ)の発現解析により比較しました。
黄色のバーは、本製品を用いた定量結果であり、左方が50ng、右側が200ngのTotal RNAを用いて得られた結果を示しています。青色のバーは弊社高効率逆転写キット「ReverTra Ace -α-®」[FSK-101]とTaqベースのリアルタイムPCR試薬「SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus-」[QPK-212]を用いて2-step系で検出を行った結果を示しています。
その結果、1-step系の本製品を用いることで、2-step系と同等な結果を迅速に得ることができることが分かりました。



 

2. TaqMan® プローブアッセイにおける性能比較

RNA-directTM VS 2酵素・1-step(装置:BioFlux社 Line Gene使用)

mRNAを鋳型とした、Taq+RTase混合型であるA社試薬(2酵素1-step系)と比較実験をおこないました。
ヒト培養細胞由来mRNA(10n倍希釈系列(n=2))を鋳型とし、TaqMan® プローブアッセイによるβアクチンmRNAの検出を行いました(100希釈の反応液20μlに5ngのPoly(A)+ RNAが含まれるように希釈)。その結果、RNA-directTM Realtime PCR Master Mixによる反応では、A社試薬推奨の反応条件においても、立ち上がりの早さと直線性において優れた結果を示しました。


 

3. SYBR® Greenアッセイおける直線性検討

RNA-directTM VS 2酵素・1-step(装置:ABI 社 PRISM® 7900HT使用)

HeLa細胞由来のTotal RNA(10n倍希釈系列(n=2))を鋳型とし、SYBR® GreenアッセイによるβアクチンmRNAの検出を行いました(100希釈の反応液20μlに75ngのTotal RNAが含まれるように希釈)。
その結果、Taq+RTase混合型であるB社キットと比較して、RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mixによる反応では、少なくとも7オーダーの希釈系列において、高い相関性を示しました。




 

4. SYBR® Greenアッセイにおける性能比較

RNA-directTM VS 1酵素・1-step(装置:Roche社 LightCyclerTM 使用)

ヒト培養細胞由来Poly(A)+RNA(10n倍希釈系列(n=2))を鋳型とし、SYBR® GreenアッセイによりG3PDH mRNAの検出を行いました(100希釈の反応液20μlに5ngのPoly(A)+ RNAが含まれるように希釈)。
その結果、同じくTth DNA Polymeraseを使用したC社試薬と比較して、RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mixによる検出では、立ち上がりの早さ、シグナルの強度、及び検出感度において大きく上回る性能を示しました。


 

参考文献

T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)

製品内容

【QRT-101,QRT-201】
Master Mix 0.5ml×5本
50XmM Mn(OAc)2 0.5ml×1本
(50μl反応で100回用、20μl反応で250回用となります)
 

基本反応条件

〈SYBR® Green I アッセイ〉
ABIPRISM®7900HT(Applied Biosystems®社)を用いる場合
滅菌水Xμl
Master Mix 25μl
50mM Mn(OAc)2 2.5μl
各Primer 10pmoles each
RNAサンプル<1μg
Total Volume 50μl


Cycle
90℃, 30sec.
61℃ 20min.

95℃ 60sec.

95℃ 15sec.
55~65℃ 15sec. 45cycles
74℃ 45sec.


※アニーリング温度は、プライマーのTmなどを考えて、55~65℃の間で調整します。
 

備考

LightCycler®は、Idaho TechnologyInc.の商標です。
SYBR®は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。
TaqMan®は、Roche Molecular Systems Inc.の登録商標です。
ABI PRISM®は、Applied Biosystems® Inc.の登録商標です。
 

ワンポイントアドバイス

●保存について
長期保存の場合は−20℃(遮光)保存をお薦めしますが、短期間に連続使用する場合、3週間程度であれば4℃(遮光)保存可能です。

●逆転写反応時のプライマーについて
PCR用のReverse Primerがそのまま逆転写用のプライマーとなります。
別途添加する必要はありません。また、Oligo dTやRandom Primerは使用できません。

●サンプル添加量について
10μlなどの少量で反応させる場合は、サンプル添加量を1μlなどの極少量にせず、希釈して2μl程度添加することにより、ピペット誤差が抑えられ良好な結果を得ることができます。

●パッシブリファレンス色素に関しまして
あらかじめ混合されています。プレートタイプのPCR機器にそのままご使用いただけます。
また、パッシブリファレンス色素を使用しないPCR機器への影響もありません。

●マンガン溶液に関しまして
RNA-directTM Realtime PCRシリーズには、必要量の酢酸マンガン溶液が別チューブ(オレンジのラベル)で添付されています。

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●RNA調製関連試薬・器具

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
MagExtractor -Viral RNA- NPK-401F 100回用 ¥32,000 4℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
MagExtractor -RNA- NPK-201F 100回用 ¥27,000 4℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
Magical Trapper MGS-101 1個 ¥38,000 室温 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。