コーヒーブレイク

■はじめに
リアルタイムPCRを行う上で、増幅長はどのくらいになるように設計するのが適切なのだろうか?
長すぎると上手くいかないイメージはあるものの、どれくらい増幅効率に影響しているのだろう?
そんな素朴な疑問を検証するべく、今回は増幅長ごとの増幅効率について検証してみました。


■実験方法
さまざまなリアルタイムPCR試薬を用いて、人工遺伝子を鋳型にフォワードプライマーを共通として増幅長が100bp,200bp,300bp,400bp,500bpになるようにリバースプライマーを設計し、各試薬の推奨反応液組成、サイクル条件でリアルタイムPCRによる増幅を行いました。

(検討したリアルタイムPCR試薬)
・A社リアルタイムPCR試薬
・B社リアルタイムPCR試薬
・C社リアルタイムPCR試薬
・D社リアルタイムPCR試薬
・THUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mix

(THUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mixを使用した例)


   滅菌蒸留水                                              7.8μL
   THUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mix   10μL
   Forward Primer                                      6pmol
   Reverse Primer                                      6pmol
   DNA                                                          1μL　　
   Total Volume                                            20μL


   95℃, 30秒
           ↓
   95℃, 5秒
   60℃, 30 秒
   ×40 cycles

そのほかのリアルタイムPCR試薬を取扱説明書記載の推奨条件で実施しました。

■結果
一般的に150bp以下に設計するように言われていますが、やはり増幅長が長くなると、ほとんどのリアルタイムPCR試薬で増幅効率の低下、または増幅不良が確認されました!

今回の検証では、すべての試薬で増幅効率が80%以上となったのは増幅長が300bpまででした!
 

■さいごに
増幅効率はテンプレートによっても異なりますので、参考としてご覧ください。

検証に使用したTHUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mixでは400bp、500bpの増幅長においても増幅効率は90%以上という結果でした!
結果がばらつく…という方はぜひ一度お試しくださいね。


今回使用した製品はこちら

THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix PCR効率を上げ、非特異反応(プライマーダイマー等の発生)を抑えることで、幅広い定量可能域(ダイナミックレンジ)を得ることができます。

THUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Master Mixシリーズの他の実施例はこちら


もっと長いターゲットを増幅したい!という方にはこちらがおすすめ

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