製品別FAQ
【KOD FLEX PCR Master Mix】
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Q KOD FLEX の特長は?
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A
KOD FX Neoの優れた特長(高効率、高成功率、クルード耐性)を持ち、かつさらに高速にPCRを行うことが可能です。 イノシン(dI)・ウラシル(dU)を含むプライマー・テンプレートにも対応しています。 マスターミックスですので、反応液調製も簡便です。
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Q KOD FX Neoとの違いは何ですか?
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A
改変型KOD DNA polymerase(UKOD)、及び伸長アクセラレーター、独自のBufferシステムを応用することで特異性・増幅効率が改善されております。また、伸長反応の時間も精製DNA(Genomic DNA・Plasmid DNA・cDNA)で GCクラスター含まないターゲットの場合は、30 sec./kb から15sec./kbに短縮されております。
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Q 正確性はどのくらいですか?
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A
測定条件にもよりますが、KOD FX Neo同様、Taq DNA Polymeraseに対して、約11倍高いというデータがございます。
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Q KOD FLEXは最大どれ位の長さまで増幅可能ですか?
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A
KOD FX Neo同様、ヒトゲノムDNAを鋳型に40kbの増幅を確認しています。
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Q 長鎖ターゲットを増幅する際のコツはありますか?
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A
>10 kbのターゲットの増幅には、長め(27mer以上)にプライマーを設計し、アニーリング(及び伸長反応)を比較的高い温度に設定します。特に、ステップダウンサイクル*での増幅が有効です。 また、精製度の低いプライマーではなく、カートリッジ精製、もしくはHPLC精製グレードのプライマーのご使用をお勧めします。
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Q マルチプレックスPCRのプライマーはどのように設計すればよいでしょうか?
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A
1) 可能な限り、各プライマーペアのTm値の差が大きくならないようにします。
2) プライマーペア間で相補的な配列を形成しないようにします。
3) マルチプレックスPCRで使用する前に、シングルプレックスPCRにて特異性と増幅効率を確かめます(その際、マルチプレックスPCRのサイクルで検討します)。 -
Q マルチプレックスPCRを行う場合、どのくらいの長さまで増幅できますか?
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A
ヒトゲノムDNAをテンプレートとした場合、約10 kbまでの複数のターゲットを安定に増幅することができます。
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Q 伸長速度はどのくらい速いのですか?
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A
精製DNA(Genomic DNA・Plasmid DNA・cDNA)でGCクラスターを含まないターゲットの場合は15 sec./ kb、GCクラスターを含むターゲットの場合は30 sec./ kb、クルードサンプル(生体試料・粗抽出液)の場合は60 sec./ kbです。
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Q プライマーのTm値の計算はどのように行えば良いですか?
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A
最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いております。プライマーのTm値計算表(EXCEL)は、こちらからダウンロードできます。
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Q PCRのサイクルの終了後に68～72℃ 7～10分の伸長ステップは必要でしょうか?
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A
必要ありません。
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Q 増幅産物の精製はどのような方法で行えば良いですか?
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A
フェノール/クロロホルム処理を行った後、エタノール沈殿を行うか、弊社の磁性ビーズを利用したDNA精製キット「MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up-[Code No. NPK-601]」を利用すると便利です。
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Q 増幅産物をそのまま制限酵素で処理して、クローニングできますか?
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A
増幅産物をクローニングに用いる場合は、制限酵素処理前に増幅産物の精製を行ってください。 DNA Polymeraseが残存している場合、本酵素の持つ3’→5’ Exonuclease活性により制限酵素処理中に突出末端が削られる可能性があります。
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Q PCR産物のTAクローニングは可能ですか?
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A
本酵素のPCR産物は平滑化されているため、直接TAクローニングすることはできません。 クローニングには、KODシリーズ専用TAクローニングキット「TArget CloneTM -Plus-[Code No. TAK-201] 」を お薦めいたします。このキットを用いると精製なしでPCR産物を高効率でTAクローニングすることができます。
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Q PCR産物がウェルに残ってしまい、電気泳動がうまくいきません。
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A
マウステールなど動物組織を直接増幅した場合、アガロース電気泳動でDNA 断片がウェルに捕捉され目的の位置に泳動されないことがあります。以下の手順で、Proteinase K処理を行ってから泳動することをお勧めします。
1) PCR産物50μLに対し、20 mg/mL Proteinase K 10μLを添加して混合します。 *特に添加後の静置は不要ですが、室温・5分程度くらいまで静置していただいても問題ございません。
2) 6×Loading Dyeを12μL添加して混合します。
3) ウェルに適量をロードして電気泳動を行います。 -
Q うまく増幅できない場合の原因と対応方法を教えてください。
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A
トラブルシューティングをご覧いただき、解決しない場合はお問い合わせください。
KOD FLEX PCR Master Mixトラブルシューティング
お問い合わせフォームはこちら
可能な範囲で結構ですので、以下の情報をお知らせいただけると幸いです。
・製品のLot No.
・サンプル(由来、処理方法)
・ターゲット(遺伝子、長さ)
・プライマー配列またはTm値
・反応液組成(液量、濃度)
・PCRサイクル
・サイクラー機器名
