実施例

ReverTra Ace qPCR RT Kit 実施例4 レア発現遺伝子の検出比較例

HeLa細胞において低発現であることが知られているTNF-α、IL-8、及びKRT(Keratin)10のmRNAの検出を各社キットを用い、検出感度を比較しました。

<実験方法>
まず、ヒト由来細胞株であるHeLa細胞から精製したTotal RNA 100ngを各社の逆転写キットを用いて逆転写反応(10μL)を行いました。次に、合成したcDNA溶液がリアルタイムPCR反応液の10%となるように添加し、リアルタイムPCR解析により、TNF-α、IL-8、及びKRT(Keratin)10遺伝子の検出効率の比較を行いました。さらに、TNF-αに関しては、リアルタイムPCR反応液の2%になるように添加したものに関して、検出限界付近での感度の比較を行いました(n=5)。本実験において、リアルタイムPCR試薬は、SYBR™ Green Realtime PCR Master Mix [Code No. QPK-201] を、検出装置はLineGene を用いました。cDNA合成は左に示す条件で行いました。

<結果および考察>
リアルタイムPCRによって測定されたCt値(表1)と、算出されたcDNA定量値(図1)を以下に示します。cDNA定量値は、それぞれの遺伝子において、全キット間で最も高かった値を100とし、各キットでの相対値を示しています。


この結果より、ReverTra Ace^® qPCR RT Kitを用いてcDNA合成した場合の相対量が最も高く検出され、高効率に逆転写されていることが示されました。
KRT10遺伝子はレア発現遺伝子という報告もあるようですが、今回の検討では発現量が比較的多いことを示す結果が得られました。これに関しては、培養条件等によって発現量が変化したことなどが理由として考えられます。


次に、TNF-αについて逆転写反応溶液を2%持ち込んでn=5で解析した結果を図2に示します。TNFαはHeLa細胞において発現量が低く、全ての反応でCt値は30を超えましたが、弊社ReverTra Ace^® qPCR RT Kitを用いた逆転写反応では、Ct値が最も小さく、高感度な検出が可能でした。また、行った5反応の成功率は100%でした。それに対し、他社キットの逆転写反応液を用いた場合は、PCR成功率自体も低く、また、Ct値も相対的に高い傾向にありました。

以上のことから、本キットはcDNA合成効率が高く、さらに逆転写反応液をリアルタイムPCR試薬へ最大20%まで持ち込むことができるため、発現量の低い遺伝子の定量にも適していると言えます。


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