実施例

KOD One 実施例18 フミン酸耐性の確認

フミン酸(humic acid)とは、腐植土や土壌などに存在する赤褐色または黒褐色の有機物であり、PCRを阻害することが知られています。通常行われるDNAの精製ではこのフミン酸は除くことはできません。そのため、環境・生態系サンプルを鋳型としたPCRはとても難しいとされています。
そこで KOD One^® PCR Master Mix および各種PCR酵素を用い、フミン酸含有下でヒトゲノムからヒトβ-globin遺伝子の増幅確認を行いました。

【サンプル】 ヒトゲノムDNA

【ターゲット遺伝子名と長さ】
　HBB　/  1.3kb

【プライマー配列】
  Forward Primer :  TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC
  Reverse Primer :  CCAGGATTTTTGATGGGACACG

【反応条件】   

(1) 反応液組成		(μL)	(2) サイクル条件
	滅菌蒸留水	Y		98℃, 10sec.		30cycles
	KOD One® PCR Master Mix	10		60℃,  5sec.
	10pmol/μL Primer F	0.6		68℃,  7sec.
	10pmol/μL Primer R	0.6		(5sec. / kb)
	OD280=1 フミン酸	X
	4ng/μL ヒトゲノムDNA	1		※KOD One® PCR Master Mix以外の PCR酵素は、それぞれ推奨の条件にて 実施しています。
	Total Volume	20

【結果】   
KOD One^® PCR Master Mix を用いた場合は、フミン酸の量にかかわらず増幅が見られ、高速PCR条件下においても高いフミン酸耐性を示す結果となりました。



M : 1kb DNA Ladder

フミン酸添加量(X)
Lane 1 : 0μL,  Lane 2 : 1μL,  Lane 3 : 2μL,  Lane 4 : 3μL,  Lane 5 : 4μL,  Lane 6 : 5μL,  Lane 7 : 6μL,  Lane 8 : 7μL

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