平滑化+ライゲーション
Blunting high
TOYOBO
価格表
| Code No. | 包装 | 価格(税別) | 保存温度 | 説明書 仕様書 |
SDS | 法規制※ | BLK-101 | 20回用 | 販売中止 | -20℃ | ― | ― | なし |
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用途
●DNAの平滑化とライゲーション
- * - * - * - 本製品は製造中止となりました。DNA末端平滑化とライゲーションの代替プロトコールをこちらに掲載しております。- * - * - * -
説明
本キットは、KOD DNA Polymeraseを用いたDNA末端の効率的な平滑化とそれに続くライゲーションを行うキットです。
DNA末端の平滑化に使用するKOD DNA Polymeraseは、超好熱始原菌Thermococcus属由来の耐熱性DNA Polymeraseであり、Polymerase活性と3'→5'Exonuclease活性を持ち、dNTPsの存在下で5'突出末端のfill in、3'突出末端のtrimを行うため、DNA末端を効率良く平滑化することができます。
また、Ligation highは1液タイプのライゲーション試薬であり、DNA溶液に混合するだけで、迅速に高効率のライゲーションが可能です。
特長
●迅速
高いDNA合成能と強い3‘→5’ Exonuclease活性を持つKOD DNA Polymeraseを採用することで短時間の反応(2分)で、DNAの完全平滑化が可能です。
●簡便
キットにはプレミックスタイプのライゲーション試薬〈Ligation high〉が添付されています。平滑反応後、簡便な操作で、高効率な平滑末端ライゲーションが可能です。
実施例
ベクターの平滑化例
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EcoRⅠ(5'端突出)とSphⅠ(3'端突出)でDouble digestionしたpUC18 DNAをBlunting highで平滑化後、Ligationを行いました。その後、反応液を用いて大腸菌の形質転換を行い、生じたコロニーを計数しました。
その結果、突出末端を持つpUC18が、本キットによって効率的に平滑化されたことが分かりました。(未切断のpUC18により得られた形質転換効率を100%として計算しました)
参考文献
1)Y. Katsuyama et al., Develop. Biol., 213: 257-268(1999)
製品使用文献
1)T. Sato et al., Appl. Environ. Microbiol., 71(7): 3889-3899. (2005)
2)N. Nakamura et al., Biol. Pharm. Bull., 28(3): 429-433. (2005)
3)H. Abea et al., FEMS Yeast Research, 4, (4-5): 417-425.(2006)
- 製品内容
KOD DNA Polymerase (2.5U/μL) 20μL
10×Blunting Buffer 100μL
Ligation high*[LGK-101]375μL
Control DNA(10ng/μL) 50μL
*安定剤として使用してるBSAが、沈殿を形成する場合がありますが、そのまま用いても効率には影響はありません。
- 注意事項
本キットの10×Blunting Bufferは、KOD DNA Polymeraseに添付されているBufferとは組成が異なります。
- 基本反応条件
<平滑化>
滅菌蒸留水 (8-X)μL
DNAサンプル XμL
10×Blunting Buffer 1μL
KOD DNA Polymerase 1μL
Total Volume 10μL
↓
72℃、2min.
<ライゲーション>
滅菌蒸留水 (10-Y)μL
平滑化DNAサンプル YμL
Ligation high 10μL
Total Volume 20μL
↓
16℃、60min.
- ワンポイントアドバイス
●形質転換への適応
ライゲーション反応後、ライゲーション産物をエレクトロポーレーション法を用いる形質転換に使用する場合には、エタノール沈殿やキットなどでの脱塩操作が必要です。
●ライゲーション反応について
Ligation highの反応は、16℃、60分間行うことをお勧めします。
また、平滑化反応液のライゲーション反応液への持ち込みが多くなると効率が低下する傾向があります。そのような場合、ライゲーションの時間を伸ばすか、平滑化反応後エタノール沈殿などを行ってTEバッファーに置換することをお勧めします。
- ※ 法規制について
- 毒： 毒物及び劇物取締法[医薬用外毒物]
- 国： 国民保護法[毒素]
- 劇： 毒物及び劇物取締法[医薬用外劇物]
- 組： カルタヘナ法(遺伝子組換え生物等の使用等の規制による
- 危： 消防法[危険物]
- 生物の多様性の確保に関する法律）
- Ｐ： PRTR法（化学物質排出把握管理促進法）[届け出義務物質]
- 申： ご購入時に申込書の提出が必要な製品
- 労： 労働安全衛生法[通知または表示義務物質]
- なし： 上記法令や申込書の提出に該当しない製品
