コーヒーブレイク

■はじめに
ロングリードシークエンス、最近盛り上がっていますよね。
なかでも Oxford Nanopore Technologies(ナノポア)のシークエンスは、手軽に測定を始められ、リアルタイムにデータを確認できる(迅速な解析ができる)点でも注目されていますね。

一方で、シークエンスのライブラリー調製は依然として工程が多く、
・より簡単に、より早くライブラリーが作れたら...
・サンプル精製さえなければ...
と思われたことはないでしょうか?

東洋紡では、高速反応が可能な PCR 酵素「KOD One^® PCR Master Mix [Code No. KMM-101]」や、精製 1 回でライブラリー調製が行える高操作性のイルミナ用 NGS ライブラリー調製試薬「GenNext^® NGS Library Prep Kit -KODEasy^®- [Code No. LPK-201]」を販売しています。
これらの製品を組み合わせることで、簡単操作で、ナノポアを用いたAmplicon-seq(PCR 産物のナノポアシークエンス)を実施、標的領域の配列決定ができており、弊社研究員のワークライフバランスの維持に貢献しております。今回はその時短術の一例 (実施例)を紹介します。


■実験方法
KOD One^® PCR Master Mix(Code No. KMM-101)を用いて、ヒト全血1µLからRAD51D(約4kb)、KRAS(約5kb)、BRCA1(約7kb)、DDB2(約10kb)をマルチプレックスPCRで増幅しました。

Oxford Nanopore Technologies の Ligation Sequencing DNA V14(Code No. SQK‑LSK114) とGenNext^® NGS Library Prep Kit -KODEasy^®-(Code No. LPK‑201) を用いて、以下のようにPCR 増幅産物のライブラリー調製を実施しました。

ライブラリーは AMPure XPによって精製し、その後 Flongle を用いてシークエンスを行いました。

1. リン酸化 & A付加
PCR増幅後の反応溶液を滅菌水で5倍希釈 (KOD One^® 増幅断片希釈溶液)
↓
KOD One^® 増幅断片希釈溶液                       12 μL
KOD Blunting Solution                                     3 μL
Phosphorylating & A-Tailing Solution            2 μL
↓
30℃      15 分
65℃      15 分
4℃        ∞

2. LAライゲーション
反応溶液(リン酸化/A付加済み)    17 μL
Ligation Adapter(LA)                        5 μL
Ligation Solution                             10 μL
↓
20℃      15 分
4℃        ∞

3. LAライゲーション産物の精製
反応溶液(LAライゲーション後)    32 μL
SPRIビーズ(AMPure XP)                16 μL
↓
よく懸濁、室温で10分間静置
↓
マグネットスタンドにセットして、上清廃棄
↓
Long Fragment Buffer(LFB)を125 µL添加し、懸濁、30秒静置
↓
マグネットスタンドにセットして、上清廃棄
↓
LFBを125 µL添加し、懸濁、30秒静置
↓
マグネットスタンドにセットして、上清廃棄
↓
15 µLのElution Bufferを添加し、懸濁、37℃で10分間静置
↓
マグネットスタンドにセットして、上清回収


■結果


GenNext^® NGS Library Prep Kit -KODEasy^®-はイルミナ用のNGSライブラリー調製試薬にはなりますが、ナノポアのライブラリー調製も可能で、PCR産物由来の配列決定ができております。
ナノポアの推奨プロトコルでは、3回のビーズ精製が必要なところ、GenNext^® NGS Library Prep Kit -KODEasy^®-では、アダプター付与後の1回のみのビーズ精製でナノポア用のライブラリー調製が可能でした。
KOD One^® PCR Master Mixは、血液などのクルードなサンプルからもPCRができ、高速反応も実施できるので、PCRからシークエンスまでの解析時間を大幅に削減できました。



KODEasy^® の技術を応用することで、強い校正活性を持つ高正確DNAポリメラーゼ (KOD DNA polymerase)で増幅したPCR断片から簡便な調製が可能となっております。

これらの結果は用いるサンプルによっても異なる可能性がありますので、参考としてお楽しみください。


■さいごに
今回使用した製品はこちら

改良版 次世代シーケンサー用ライブラリー調製キット
GenNext^® NGS Library Prep Kit -KODEasy^®-

●精製が1回: 簡便で、チップなどの消耗品を大幅に削減
●1チューブで反応: 簡便で、サンプルの取り違えを防止
●操作性の向上: 添加する試薬量が ≧3μL
●増幅のバイアスを低減: GCリッチなターゲットも良好な増幅

※「KODEasy」「GenNext」は東洋紡株式会社のNGS関連試薬を示す商標または登録商標です。
* 記載している会社名および・ロゴマークなどは、各社の商号、商標または登録商標です。