コーヒーブレイク

■はじめに
qPCRの蛍光強度、普段どの程度意識されていますか?
qPCRの結果を評価する際、Ct値や増幅曲線に注目される方は多いかと思いますが、実は蛍光強度も重要な指標のひとつです。
蛍光強度が高いと、Ct値の判定が安定しやすくなり、ピペッティング誤差などの技術的なばらつきにも強く、再現性の高い定量が可能になります。しかしながら、この点は意外と見落とされがちです。
そこで今回は、当社の THUNDERBIRD^® Next SYBR^™ qPCR Mix と他社製品を用いて、蛍光強度を比較しました。

■実験方法
逆転写反応用試薬 ReverTra Ace^® qPCR RT Kit [Code No.FSQ-101]を用いて、HeLa細胞total RNAからcDNAを合成しました。cDNAの6倍希釈(6段階)したサンプルを THUNDERBIRD^® Next SYBR^™ qPCR Mix [Code No.QPX-201]、および他社試薬を使用してqPCRを行い、蛍光強度を比較しました。


[反応液組成]
THUNDERBIRD^® Next SYBR^™ qPCR Mix
滅菌水                                                                         X μL
THUNDERBIRD^® Next SYBR^™ qPCR Mix          10 μL
Forward Primer                                                          6 pmol
Reverse Primer                                                          6 pmol
DNAサンプル                                                             Y μL                   
Total Volume                                                            20 μL

*他社品については、プロトコルに従って調製

[PCRサイクル条件]
使用機器: StepOnePlus^™

95℃, 60sec
     ↓
95℃, 5sec
60℃, 10sec　 40 cycles


■結果





THUNDERBIRD^® Next SYBR^™ qPCR Mixは、他社製品と比較して一貫して高い蛍光強度を示しました。
特に低濃度サンプルでも蛍光強度の高い明瞭なシグナルが得られ、定量の再現性や感度の面で優れた性能が示されました。


■最後に
今回使用した製品はこちら
高効率リアルタイムPCR用マスターミックス
THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mix 


組成の最適化によりPCRの特異性が向上しています。
PCR効率を上げ、非特異反応(プライマーダイマー等の発生)を抑えることで、幅広い定量可能域(ダイナミックレンジ)を得ることができます。
また伸長時間10秒の高速サイクルにも対応しており、実験の効率UPに最適です。

* 「SYBR」 は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。
* 「StepOnePlus」は、Applied Biosystems Inc.の商標です。
* 「ReverTra Ace」「SuperPrep」は東洋紡株式会社のcDNA合成関連試薬を示す登録商標です。
* 「GenNext」は東洋紡株式会社のNGS関連試薬を示す登録商標です。