コーヒーブレイク

■はじめに
96ウェルプレートで培養した細胞などサンプル数が多いと、RNA抽出は時間も手間もかかって大変ですよね、そのお悩み解決できます!
弊社SuperPrep^®を使えば、細胞から精製することなくcDNA合成が可能です。さらに、さまざまなリアルタイムPCR試薬(SYBR™ Green I、TaqMan^®アッセイ両方に対応可能)と組み合わせることで細胞内のRNAを簡便に定量することができます。
今回は、実際に薬剤処理の前後で細胞の遺伝子発現の変化を測定し、アッセイ系のバラツキを評価してみました!

■実験方法
PMA処理した細胞と未処理の細胞(n=12)から、SuperPrep^®でRNA精製なしでcDNAを合成。そのcDNAを使って、遺伝子発現を解析し、A社製品と比較しました。

詳細、弊社試薬の反応条件は以下のとおり。
HeLa S3細胞を96ウェルプレートに2×10⁴cells/wellずつ播種し、100nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)を加えて24時間インキュベートしました。その後、PMA処理した12ウェル、未処理の12ウェルについてPBS(-)で細胞を洗浄し、SuperPrep^®II Cell Lysis & RT Kit for qPCR[Code No.SCQ-401]で処理してcDNA合成を行いました。
このcDNAを鋳型にTHUNDERBIRD^® Probe qPCR Mix [Code No.QPS-101]を用いてIL-6、IL-1β、β-actin遺伝子についてTaqMan^® プローブアッセイを行いました(n=12にて実施)。同様にA社同等品を用いてリアルタイムPCR解析を行いました(逆転写反応試薬とリアルタイムPCR試薬もA社キット付属品を使用)。
IL-6、IL-1β遺伝子のCt値をβ-actin遺伝子で補正し(ΔCt)、PMA処理の有無の差(ΔΔCt)を算出しました。続いてZ’-factorを算出し、比較を行いました。

[細胞ライセートの調製]
溶解液(Lysis Solution)の調製   1反応
 Lysis Solution                            58.7 μL
 RNase Inhibitor                               1 μL
 gDNA Remover                            0.3 μL

上記Lysis Solution (RNase Inhibitor 及び gDNA Remover 含有) 60μLにHeLa細胞を添加し振とう 室温 30sec、インキュベート 室温 4min 30sec

[cDNA合成反応]
5×RT Master Mix                              8μL
RNA溶液(上記細胞ライセート)     8μL
Nuclease-free Water                      24μL　
Total Volume                                   40μL  

37℃, 15 min 50℃, 5 min

98℃, 5 min

4℃, hold


[qPCR反応組成]
THUNDERBIRD^® Probe qPCR Mix             10 μL
10μM Forward Primer                                 0.6 μL (6 pmol)
10μM Reverse Primer                                 0.6 μL (6 pmol)
50×ROX reference dye                                0.4 μL
Nuclease-free Water                                   6.4 μL
cDNA溶液                                                         2 μL        　
Total Volume                                                 20 μL

[PCRサイクル条件]
使用機器: StepOnePlus^TM

95℃, 60sec
     ↓
95℃, 15sec
60℃, 60sec　 40 cycles


■結果





この結果、いずれもZ’-factorとしてはアッセイ系の質の目安となる0.5をクリアしましたが、SuperPrep^®II Cell Lysis & RT Kit for qPCR、THUNDERBIRD^® Probe qPCR Mix [Code No.QPS-101]を用いた実験において、A社の試薬と比較して高いZ’-factorを示し、アッセイ系としてよりバラツキが少なく良好であることが分かりました。


■最後に
今回使用した製品はこちら
リアルタイムPCR用細胞溶解&cDNA合成キット(培養細胞用)
SuperPrep^® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR-


●RNA精製不要
●ライセートから高品質なcDNAを合成
●幅広い哺乳類細胞を用いることが可能
●ハイスループット解析のバラツキ低減

* 「Applied Biosystems」 は、Applied Biosystems Inc.の登録商標です。
* 「StepOnePlus」は、Applied Biosystems Inc.の商標です。
*「SuperPrep」は東洋紡株式会社のcDNA合成関連試薬を示す登録商標です。
*「GenNext」は東洋紡株式会社のNGS関連試薬を示す登録商標です。