コーヒーブレイク

■はじめに
リアルタイムPCRで遺伝子の発現量を解析する際、十分なRNA量がとれなかったことはないですか?
そのような微量RNAを解析するにはcDNA増幅ができるqPCR用逆転写試薬QuantAccuracy^®, RT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit [Code No. RMQ-101]の使用がお勧めです。今回、QuantAccuracy^®を使用して、反応時間を延ばすことで合成されるcDNA量を比較してみました。

■実験方法
10pgのTotal RNAからQuantAccuracy^®, RT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit [Code No. RMQ-101] とRT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit [Code No. RMD-201]、一般的な逆転写試薬を用いて、逆転写反応時間を30分から6時間まで延ばして、cDNAを合成しました。その後、THUNDERBIRD^® SYBR^TM qPCR Mix [Code No. QPS-201] を用いてcDNA中のNEAT1 middle遺伝子を増幅し、cDNA合成量を比較しました。

QuantAccuracy^® cDNA合成反応条件

【RNA希釈液の調製】
Lysis Buffer                           2μL
Lysis Enhancer                0.45μL
RNase Inhibitor               0.05μL
10pg Total RNA                    1μL
Nuclease free water         1.5μL　　
Total                                       5μL

【熱変性反応】
75℃      1.5 min
4℃        hold

【cDNA合成 反応液の調製】
RT-RamDA^® Buffer                        1.2μL
gDNA Remover                            0.45μL
RT-RamDA^® Enzyme Mix             0.5μL
RT-RamDA^® Primer Mix               0.5μL
Nuclease free water                   1.35μL 　
Total                                                    4μL

上記混合液を熱変性後の反応液5μLに添加。

【cDNA合成および増幅反応】
25℃      10 min
30℃      10 min
37℃      30 min, 2hr, 4hr, 6hr
50℃        5 min
98℃        5 min
4℃        hold

その他の逆転写試薬は取扱説明書に従い、実施しました。


qPCR反応液

滅菌水                                                                XμL
THUNDERBIRD^® SYBR^TM qPCR Mix           10μL
Forward Primer                                                6pmol
Reverse Primer                                                 6pmol
50×ROX reference dye                                 0.4μL
DNAサンプル                                                    YμL                   
Total Volume                                                  20μL


PCRサイクル条件
使用機器:Applied Biosystems^® StepOnePlus™ リアルタイムPCRシステム

THUNDERBIRD^®  SYBR^TM qPCR Mix
95℃　1min
↓
95℃　15sec
60℃　45sec×40cycle


■結果



QuantAccuracy^®, RT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit [Code No. RMQ-101] やRT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit [Code No. RMD-201] は、推奨反応時間の30分でも一般的な逆転写試薬と比べて、Ct値が5程度早くなりました。また、RT-RamDA^® cDNA Synthesis Kitや一般的な逆転写試薬は、反応時間を長くしてもCt値がほとんど変化しないのに対して、QuantAccuracy^®は反応時間を延ばすことでCt値が更に2程度早まりました。

cDNA増幅能のあるQuantAccuracy^®を用いれば微量RNAからでも安定した結果が得られます。推奨反応時間の30分で十分な効果が見られますが、それでもうまくいかない場合は反応時間を延ばすと改善がみられるかもしれないです。

これらの結果は、解析するサンプルにもよりますので、参考としてお楽しみください。。


■さいごに
今回使用した製品はこちら
QuantAccuracy^®, RT-RamDA^® cDNA Synthesis Kit



● シングルセルや微量RNAからcDNA調製可能
 1～500細胞または10 ng Total RNA以下の微量RNAからcDNAを調製可能です。

● 検出の難しいサンプルでも解析が可能
 cDNA増幅能を活かし、分解が進んだFFPE標本RNAなどの検出の難しいサンプルを解析可能です。
 

*「RT-RamDA」は国立研究開発法人理化学研究所の登録商標です。
*「QuantAccuracy」「THUNDERBIRD」は東洋紡株式会社の登録商標です。
*記載している会社名および・ロゴマークなどは、各社の商号、商標または登録商標です。