コーヒーブレイク

■はじめに
RNA抽出が面倒!細胞から直接qPCRできたらいいのに…と思ったことはありませんか?そんな方には弊社SuperPrep^®がおすすめです!
細胞から精製することなくcDNA合成が可能で、細胞内のRNAを簡単に定量することができます。

今回は、SuperPrep^®と弊社qPCR試薬を用いて、どれくらいの量の細胞から直接cDNA合成とqPCRができるか、製品性能ぎりぎりに挑戦してみました!


■実験方法
SuperPrep^® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR [Code No. SCQ-401] を用いて、HeLa細胞1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵cellsから細胞ライセートを調製しcDNA 合成 (40 μL 反応系)を行いました。
それぞれのcDNAを鋳型にTHUNDERBIRD^® SYBR qPCR Mix [Code No.QPS-201]、KOD SYBR™ qPCR Mix [Code No.QKD-201]、THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mix [Code No.QPX-201] を用いて、リアルタイムPCRを行いました。

[細胞ライセートの調製]
溶解液(Lysis Solution)の調製
                                 1反応分
 Lysis Solution        58.7 μL
 RNase Inhibitor           1 μL
 gDNA Remover        0.3 μL

上記Lysis Solution (RNase Inhibitor 及び gDNA Remover 含有) 60μLにHeLa細胞を添加し振とう 室温 30sec、
インキュベート 室温 4min 30sec

cDNA合成反応
5×RT Master Mix                              8μL
RNA溶液(上記細胞ライセート)     8μL
Nuclease-free Water                      24μL　
Total Volume                                  40μL   

37℃, 15 min50℃, 5 min
98℃, 5 min
4℃, hold


qPCR反応組成
THUNDERBIRD^® SYBR qPCR Mix [Code No.QPS-201]、KOD SYBR™ qPCR Mix [Code No.QKD-201]、THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mix [Code No.QPX-201] を用いcDNAをそれぞれ検出しました。

1.
THUNDERBIRD^® SYBR qPCR Mix            10 μL
10μM Forward Primer                               0.6 μL (6 pmol)
10μM Reverse Primer                               0.6 μL (6 pmol)
50×ROX reference dye                              0.4 μL
Nuclease-free Water                                  6.4 μL
cDNA溶液                                                       2 μL        　
Total Volume                                               20 μL

2.
KOD SYBR™ qPCR Mix                              10 μL
10μM Forward Primer                              0.4 μL (4 pmol)
10μM Reverse Primer                               0.4 μL (4 pmol)
50×ROX reference dye                             0.4 μL
Nuclease-free Water                                 6.8 μL
cDNA溶液                                                      2 μL            
Total Volume                                               20 μL

3.
THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mix           10 μL
10μM Forward Primer                                         0.6 μL (6 pmol)
10μM Reverse Primer                                          0.6 μL (6 pmol)
Nuclease-free Water                                            6.8 μL
cDNA溶液                                                                  2 μL     　
Total Volume                                                           20 μL


PCRサイクル条件
使用機器: StepOnePlus^TM

1.THUNDERBIRD^® SYBR^TM qPCR Mix
 95℃, 60sec
     ↓
 95℃, 15sec
 60℃, 60sec　 40 cycles

2.KOD SYBR™ qPCR Mix
 98℃, 120sec
      ↓
 98℃, 10sec
 60℃, 10sec
 60℃, 30sec　 40 cycles
 Melting / Dissociation Curve Analysis

3.THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mix
 95℃, 30sec
      ↓
 95℃, 5sec
 60℃, 30sec　 40 cycles 
 Melting / Dissociation Curve Analysis


■結果
1.THUNDERBIRD^® SYBR™ qPCR Mix

2.KOD SYBR™ qPCR Mix

3.THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mix

1.THUNDERBIRD^® SYBR™ qPCR Mixでは細胞の量が多いとCt値が遅れており、阻害がかかってしまいましたが、2.KOD SYBR™ qPCR Mixと3.THUNDERBIRD^® Next SYBR™ qPCR Mixは、1×10¹～1×10⁵cellsまで鋳型量依存的に等間隔に立ち上がるきれいな増幅曲線を得ることができました。


■さいごに
今回使用した製品はこちら
SuperPrep^®ⅡCell Lysis & RT Kit for qPCR

●RNA精製不要 ●ライセートから高品質なcDNAを合成 ●幅広い哺乳類細胞を用いることが可能 ●ハイスループット解析のバラツキ低減

* SYBR™ は、Molecular Probes Inc.の商標です。
* Applied Biosystems^® は、Applied Biosystems Inc.の登録商標です。
* StepOnePlus™ は、Applied Biosystems Inc.の商標です。