コーヒーブレイク

■はじめに
リアルタイムPCRの際、「調製に時間がかかっているけど大丈夫かな…」とか「試薬調製しちゃったけど、ちょっと実験止めたい!」と思ったことはありませんか?
今回は、実際のところ反応液を放置したらどうなるのか、研究員に試してもらいました。

■実験方法
当社の2種類の製品(THUNDERBIRD^® SYBR^® qPCR MixとTHUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mix)を使用して、PCR反応液にプライマーとテンプレート(HeLa細胞total RNA由来のcDNA)を混合した直後、または遮光室温で48時間インキュベートした後にターゲットの増幅を行いました。


(THUNDERBIRD^® SYBR^® qPCR Mix)
滅菌水                                                                         6.6μL
THUNDERBIRD^® SYBR^® qPCR Mix                         10μL
Forward Primer                                                         0.5μL(6pmol)
Reverse Primer                                                         0.5μL(6pmol)
50× ROX reference dye                                            0.4μL
HeLa細胞total RNA由来cDNA(RNA 16pg相当)       2μL　　　 
Total Volume                                                               20μL

(THUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mix)
滅菌水                                                                            7μL
THUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mix                10μL
Forward Primer                                                          0.5μL(6pmol)
Reverse Primer                                                           0.5μL(6pmol)
HeLa細胞total RNA由来cDNA(RNA 16pg相当)       2μL　        
Total Volume                                                               20μL

 
使用機器:Applied Biosystems^® StepOnePlus^TM

(THUNDERBIRD^® SYBR^® qPCR Mix)
初期変性 95℃ 60 秒
↓
PCR 変性 95℃ 15 秒 → 伸長 60℃ 30 秒 (40 cycles)
↓
融解曲線分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)

(THUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mix)
初期変性 95℃ 30 秒
↓
PCR 変性 95℃ 5 秒 → 伸長 60℃ 30 秒 (40 cycles)
↓
融解曲線分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)


■結果
THUNDERBIRD^® SYBR^® qPCR Mix(弊社従来品リアルタイムPCR試薬)では室温48時間経過後、ΔCt0.5～1.7の遅れが確認されましたが、THUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mixは 室温48時間 経過後でもCt値の遅れがありませんでした!

■さいごに
というわけで、サンプル数が多い時も、うっかり機械が空いていなかった時も安心のTHUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mix!ですね。
Primer やサンプルによっても反応液の安定性は異なりますので、目安としてご参照ください。

今回使用した製品はこちら

THUNDERBIRD^® Next SYBR^® qPCR Mix

組成の最適化によりPCRの特異性が向上しています。PCR効率を上げ、非特異反応(プライマーダイマー等の発生)を抑えることで、幅広い定量可能域(ダイナミックレンジ)を得ることができます。

*SYBR^® は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。
*Applied Biosystems^®は、Applied Biosystems LLCの登録商標です。
*StepOnePlus^TMは、Applied Biosystems LLCの商標です。