製品別FAQ
【KOD -Multi & Epi-】
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Q 正確性はどのくらいですか?
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A
測定条件にもよりますが、KOD FXやKOD FX Neo同様、Taq DNA Polymeraseに対して、約10倍高いというデータがございます。
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Q 2× PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-に含まれているMg2+ 濃度を教えてください。
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A
Buffer中には4.0 mM (反応液の終濃度は2.0 mM)のMg2+が含まれています。
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Q KOD -Multi & Epi-は最大どれ位の長さまで増幅可能ですか?
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A
ヒトゲノムDNAを鋳型に40kbの増幅を確認しています。
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Q マルチプレックスPCRのプライマーはどのように設計すればよいでしょうか?
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A
1) 可能な限り、各プライマーペアのTm値の差が大きくならないようにします。
2) プライマーペア間で相補的な配列を形成しないようにします。
3) マルチプレックスPCRで使用する前に、シングルプレックスPCRにて特異性と増幅効率を確かめます(その際、マルチプレックスPCRのサイクルで検討します)。 -
Q マルチプレックスPCRを行う場合、どのくらいの長さまで増幅できますか?
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A
ヒトゲノムDNAをテンプレートとした場合、約10 kbまでの複数のターゲットを安定に増幅することができます。
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Q イノシンを含むプライマーのTm値はどのように計算すればよいでしょうか?
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A
ミスマッチを含むプライマーと同様に、イノシンを除いた配列で大まかなTm値を求め、その値を参考に最適条件を検討してください。
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Q ウラシルを含むプライマーのTm値はどのように計算すればよいでしょうか?
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A
ウラシル(U)をチミン(T)として計算してください。
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Q バイサルファイト処理したDNAをテンプレートとする場合、どのくらいの長さまで増幅できますか?
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A
約1.5 kbまでのターゲットを増幅することができます。
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Q バイサルファイトPCRプライマーどのように設計すればよいでしょうか?
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A
バイサルファイト変換後ではメチル化されていないシトシンがウラシルに変換されているため、フリーのオンラインツールのMethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)などの専用の設計ツールを利用することを推奨します。
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Q 増幅が見られないのですが、どうしたらよいでしょうか?
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A
以下の対応が考えられます。
1) 伸長時間を60 sec./ kbに延長します。
2) サイクル数を2～5サイクル増やします。
3) 3ステップサイクルで行っている場合、アニーリング温度を下げてTmからTm-5℃の間で検討します。
4) 縮重プライマーを使用している場合、アニーリング時間を10 sec.から30 sec.に伸ばします。
5) テンプレートの量を増やします。
6) cDNAサンプルの場合、RNAによる阻害をなくすため、サンプル量を減らします。
7) プライマー濃度を0.3μMから0.1μM(終濃度)まで段階的に減らして検討します。
(特に10 kb以上の長鎖ターゲットで有効な場合があります)。
縮重プライマーを使用している場合はプライマー濃度を上げます。
8) 使用酵素量の標準1.0 Uを1.5～2.0 Uに増やす。 -
Q スメア、エキストラバンドが見られるのですが、どうしたらよいでしょうか?
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A
以下の対応が考えられます。
1) 3ステップサイクルで行っている場合、2ステップサイクルに変更します。
2) サイクル数を2～5サイクル程度減らします。
3) テンプレートの量を減らします。
4) プライマー濃度を0.1μM(終濃度)まで段階的に減らして検討すします。
5) 長めのプライマーを設計します。
6) 使用酵素量の標準1.0 Uを0.5～0.8 Uに下げます。 -
Q PCR産物のTAクローニングは可能ですか?
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A
KOD -Multi & Epi-® の増幅産物の末端は平滑化されているため、専用TAクローニングキット「TArget Clone -Plus-[Code No. TAK-201]」を用います。(キットの試薬でPCR産物の3'末端にAを付けて、付属のTベクターにライゲーションします。)
