実施例

KOD FX 実施例36 コロニーPCRによる各種細菌DNAの検出

【サンプル】

●実験A  嫌気性の腸内細菌(Bacteroides fragilis ATCC25285, Bifidobacterium adolescentis GAI1275, Peptostreptococcus magnus GAI5528,
Lactobacillus acidophilus GAI1132)のコロニー

●実験B  Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Salmonella enteritidisのコロニー

●実験C  腸管出血性大腸菌の変異株GPU995、大腸菌K-12株のC600、臨床分離株の大腸菌Nagoyaのコロニー

【サンプルの処理】

●実験A  嫌気ステーション内でGAM培地上に増殖したコロニーをピペットチップの先に取り、PBSに懸濁して、そのチップを直接、反応液に浸けて懸濁。

●実験B  LB培地上に増殖したコロニーをマイクロピペッターのチップの先で触れ、PBSに懸濁し、そのチップを直接PCR反応液に浸けて懸濁。

●実験C  LB培地上に増殖したコロニーを直接ピペットチップの先に取り、反応液に懸濁。

【遺伝子名・ターゲット長】

●実験A  ssu (16S rDNA遺伝子), 約1kb

●実験B  16S rDNA遺伝子, 約1kb

●実験C  espA (TypeIII分泌装置の一部), ssu (16S rDNA遺伝子)、それぞれ約600bpと約1kb

【反応液組成】

●実験A  バッファー10μL + dNTP 4μL + 水 5μL + プライマー0.3+0.3 μL(1.5 μM) + 酵素 0.4μL  ※A社酵素も同じ組成

●実験B  バッファー 10μL + dNTP 4μL + 水 5 μL + プライマー 0.3 + 0.3μL (1.5 μM) + 酵素 0.4μL  ※A社酵素も同じ組成

●実験C  バッファー10μL + dNTP 4μL + 水 4.8μL + プライマー0.4 + 0.4μL (1.5 μM) + 酵素 0.4μL  ※A社酵素も同じ組成

【PCRサイクル条件】

96℃, 2 min.
↓
(95℃ 30sec.,   50℃  30sec.,   72℃ 1min.) × 40 cycles

※A社PCR酵素も同じサイクル



【コメント・ご意見】

●実験A
菌種によってPCRのかかり具合が違うが、KOD FXのほうが効率よく増幅されているようです。

●実験B
いずれも増幅できたが、KOD FXは増幅効率がよい。セラチアではスメアになりにくく、特異的なバンドがはっきりした。

●実験C
O157とそうでない大腸菌を区別できました。どちらもほぼ同様に増幅できましたが、KOD FXのほうがやや特異性の高い反応条件であったようです。

【データご提供】

岐阜薬科大学微生物学研究室
吉田朋未 様、高橋圭太 様、後藤麻美 様、杉山剛志 先生


KOD FX 製品ページ
実施例一覧ページ