実施例

KOD FX 実施例30 カビ(Aspergillus oryzae)からのダイレクトPCR

KOD FX は、酵母やカビのコロニーPCRを行うことが可能です。

【サンプル】
  カビ菌体(懸濁液)

【前処理】
  懸濁(菌体を直接使用)    <ピペットでカビをかきとり、TEバッファー50 μLに懸濁する>

【ターゲット】
  Aspergillus oryzae amy gene for alpha-amylase　2.1 kb

【プライマー】
  F: CCATGCTTGGAGGATAGCAA  (Tm 58.7)
  R: CACTGTCCAATGCCAGATTG  (Tm 57.8 )

【反応液組成】                          (μL)
PCR grade water                        7
2×PCR buffer for KOD FX       25
2 mM dNTPs                            10
10 pmol/μL Primer F                 1
10 pmol/μL Primer R                 1
KOD FX (1.0 U/μL)                     1    
カビ懸濁液　　　　　　     　 5   
 Total                                         50      

【PCR サイクル】
   94℃ 5 min.
   ↓
   (98℃ 10 sec., 55℃ 30 sec., 68℃ 2 min.) 35 cycles
   ↓
   4℃ ∞

   ※A社高効率PCR酵素は推奨条件を用いて行いました。

【結果】

特別な前処理なしで、良好に増幅することができました。カビのコロニーを直接用いても問題なく増幅できましたが、コロニーを持ち込み過ぎた場合、再現性が得られない場合がありました。そこで、コロニーピックしたものを、TEバッファー50 μL 程度に懸濁し、その5 μLをKOD FXのPCR反応液(総量50 μLの系)に添加したところ再現性よく増幅することができました。


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