実施例
KOD FX 実施例28 マウス尾溶解液からのゲノムDNAの増幅
≪実験1. マウス尾溶解液を用いたPCR効率比較≫
≪実験2. プラスミドサンプルを用いたPCR効率比較≫
【サンプル】
実験 1) mouse tail lysed with Proteinase K 0.5 μL
実験 2) Plasmid (20 ng)
【ターゲット】ターゲット遺伝子名、増幅サイズ
実験 1) pGKneo, 500 bp
実験 2) CAG promoter region + GFP, 3 kb
【プライマー配列】
実験 1) forward, reverse共に20 mer
実験 2) forward, 21 mer; reverse, 29 mer
【反応液組成】
●KOD FX
PCR grade water X μL
2× PCR buffer for KOD FX 7.5 μL
2mM dNTPs 3 μL
10pmol /μL Primer #1 0.45 μL
10pmol /μL Primer #2 0.45 μL
KOD FX (1.0U/μL) 0.3 μL
サンプル Y μL
--------------------------------------------------------
Total reaction volume 15 μL
※他社品は取説に従い調製を行いました。
【サイクル】
実験 1)
95℃ 2min.
↓
(95℃ 30 sec., 56℃ 30 sec., 72℃ 30 sec.) 36 cycles
↓
4 ℃, forever
実験 2)
95℃ 2 min.
↓
(98℃ 10 sec., 60℃ 30 sec., 72℃ 3 min.) 33 cycles
↓
4 ℃, forever
【結果】
実験 1)
実験 2)
【データご提供】
高知大学医学部解剖学講座
三井 真一 先生
【先生からのコメント】
想像以上に増幅効率が高く、驚きました。
マウステールの処理ですが、以下のように行っています。3～5 mmの長さに切ったマウステールに500 μLのLysis buffer (100 mM Tris-Cl, pH8.5, 5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.2% SDS, 100μg/mL Proteinase K)を加えて56℃で一晩混合する。この溶解液の0.5 μLをテンプレートとして反応液に加えています。Proteinase Kの失活操作はしていません。overnightで処理しているうちに自己分解して失活するようです。経験上、加える液量が過剰であったり、テールの溶解時間が短い(数時間程度;テールは一応溶解しています)とバンドの出方が悪い気がしています。
KOD FX 製品ページ
実施例一覧ページ
