実施例

KOD FX 実施例22 コロニーPCRによる酵母形質転換体の確認

≪Zymolyase処理あり≫

【遺伝子名】
Xanthophyllomyces dendrorousからクローニングし、Saccharomyces cerevisiae Y187にプラスミドの状態で導入した配列4種(A-D)

【サンプル】
上記配列を導入したS. cerevisiae Y187のコロニーをつまようじで少量とり、Zymolyase溶液(Zymolyase 2.5 mg/mL、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5、1.2 Mソルビトール)10 μLに懸濁し、37℃  30分インキュベート。PCR反応液を調製し、上記の液をtemplateとして1 μL加えた(total 20 μL)。

【ターゲット長】
約3,000 bp

【プライマー条件】
Forward 22 mer   5’-ctattcgatgatgaagataccc-3’
Reverse 19 mer   5’-aaattgagatggtgcacga-3’

【サイクル】
KOD-FX:  94℃ 4 min
              (98℃ 10 sec.,60℃ 30 sec., 68 ℃ 4 min.)×30cycles
            　4℃　∞

他社酵素:推奨条件(30cycles)



≪Zymolyase処理なし≫

【遺伝子名】
他種酵母のcDNAライブラリー

【サンプル】
上記cDNAライブラリーを導入したS. cerevisiae Y187を直接PCR反応液に懸濁した。

【ターゲット長】
約500～4,000 bp

【プライマー条件】
Forward 22 mer   5’-ctattcgatgatgaagataccc-3’
Reverse 19 mer   5’-aaattgagatggtgcacga-3’

【サイクル】
KOD-FX:  94℃ 4 min
              (98℃ 10 sec.,60℃ 30 sec., 68 ℃ 4 min.)×30cycles
              4℃　　∞



【データご提供】
奈良先端科学技術大学院大学　細胞機能学講座　
浮辺健先生、大津厳生先生、高木博史先生

【先生からのコメント】
以前から他社のポリメラーゼを用いて酵母のコロニーPCRを行っていたが、ちょっとした条件の違い(コロニーの年齢、使用する菌体の量)などで増えたり、増えなかったりということが頻繁に起きていた。
このKOD FXを使ってすでに100回以上コロニーPCRを行ったが、今までに増幅に失敗したことはない。
さらに、酵母菌体をZymolyaseで処理せずに(大腸菌のコロニーPCRと同様に)、PCR溶液に直接菌体を加える方法でも問題なく増幅できる。


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