実施例

KOD One 実施例22 微量の DNA から実施できるロングリード DNA メチル化解析手法

東洋紡の試薬を用いて、ウラシルを多く含む酵素処理後の鋳型から長いDNAフラグメントが得られた論文が報告されましたので、一部を紹介させていただきます。

Sakamoto, Y. et al., Long-read whole-genome methylation patterning using enzymatic base conversion and nanopore sequencing. Nucleic Acids Research. Vol. 49, No. 14, 20 August 2021, P. e81  より引用

【実験方法】
g-TUBE(Covaris)を用いて、平均鎖長~10kb程度にゲノムDNAを断片化し、上記断片化ゲノムDNA 50ngを NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit (New England BioLabs) を用いてアダプター付与、非メチル化シトシンのウラシルへの変換を行いました。

処理後の断片化DNA と NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit 付属の EMseq Index primer を用い、KOD One^® PCR Master Mix またはKOD -Multi & Epi-^®、他社試薬2種の合計4種の試薬でPCRを実施しました。

【KOD One^® PCR Master Mix サイクル】
98℃, 10 sec.
57℃, 5 sec.
68℃, 15 min.  ×15 cycles

【KOD -Multi & Epi-^®サイクル】
94℃, 2 min.
↓
98℃, 10 sec.
62℃, 30 sec.
68℃, 10 min.  ×16 cycles
68℃, 10 min.

※他社試薬のサイクル条件は論文中に記載

【結果】
増幅産物長の分布を比較した結果、KOD One^® PCR Master Mix またはKOD -Multi & Epi-^®を用いた場合、10kbを超えるライブラリーがしっかり増幅されていることが確認されました。長鎖のメチル化解析には弊社酵素の方が最適な結果でした。





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