実施例

KOD One 実施例11 高GC配列 mouse c-Maf cDNA全長配列の増幅

データご提供 : 福島県立医科大学 医学部 放射性同位元素研究施設  関亦 正幸 先生

<実験の目的>
動物細胞発現ベクター構築のための mouse c-Maf cDNA全長配列を増幅する。

<実験方法>

【サンプルの種類】
マウスT細胞から抽出したtotal RNA

【サンプルの調製方法】
ISOGEN(ニッポンジーン)によりtotal RNAを調製し、その後PrimeScript RT Master mix(Perfect Real Time)(タカラバイオ)にてcDNA合成したものを鋳型に用いた。

【ターゲット遺伝子名と長さ】
mouse c-Maf cDNA / 1.2 kb 

【プライマー配列】
Forward Primer:GGGATCCGATGGCTTCAGAACTGGCAA
長さ: 27 mer                   Tm: 65.1 ℃

Reverse Primer:GGTCGACCATGAAAAATTCGGGAGAGG
長さ :27 mer                   Tm: 63.5 ℃

■KOD One^® PCR Master Mix -Blue-、A社 高速・高正確 PCR Master Mix 共通

【反応液組成】                                                            【PCRサイクル】

		(μL)
	各PCR Master Mix	3		94℃   2min.
	10μM Primer F	1		98℃  10sec.
	10μM Primer R	1		55℃    5sec.		30cycles
	cDNA	1		68℃  15sec.
	Total Volume	6

 ※A社 高速・高正確 PCR Master Mixの条件でPCRを行っています。 

 【サイクラー機種】
Bioer Technology  LifeECO ver 2.0

<結果・考察>
KOD OneはGC含量の多いc-Maf cDNAの1.2 kbを増幅することができた。A社高速・高正確 PCR Master Mixは増幅できるがGC含量の多い領域を欠失した産物ができる。

<感想・ご意見等>
増幅配列はGC含量が70%と高く、局所的に94%を超えてGCが連続する配列が存在している。そのため、通常のTaqポリメラーゼでは増幅できないか、できたとしても高連続GC配列を欠失した短鎖として増幅されてしまう。DMSOを添加することでPCR反応が改善されることはあるが、常に安定した結果が得られるかは不明である。比較のA社高速・高正確 PCR Master Mixも、その中においては増幅能力の高い正確性の高い酵素であるが、図(レーン2)にあるように高連続GC配列を欠失した短鎖として増幅されている。これに対して、KOD One^® PCR Master Mix -Blue-(レーン1)では、全長の1.2kbの増幅がメインのバンドとして検出されている。このメインバンドをクローニングし、シークエンスしたところ塩基配列が正しいことが確認できた。このことから、KOD One^® PCR Master Mix -Blue-は、高連続GC配列の正確な増幅にも適していることが判明した。
 

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