⾼速・⾼正確・⾼成功率PCR Master Mix(長鎖ターゲット増幅用)

KOD Long PCR Master Mix

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TOYOBO

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価格表用途説明特長実施例

価格表

Code No.	包装	価格(税別)	ｷｬﾝﾍﾟｰﾝ価格(税別)	保存温度	説明書仕様書	SDS	法規制^※
KML-101	1mL×5本	￥46,000	￥27,600	-20℃	Ｍ	Ｓ	なし
KML-101X5	(1mL×5本)×5	￥184,000	￥128,800	-20℃	Ｍ	Ｓ	なし
KML-101X10	(1mL×5本)×10	￥345,000	―	-20℃	Ｍ	Ｓ	なし

用途

●PCR

説明

本製品は改変型KOD DNA polymerase(UKOD)を含んだPCR用2×マスターミックスです。
高い正確性・増幅効率をもつ改変型KOD DNA polymerase(UKOD)に、伸長アクセラレーターを添加することで、高い正確性を維持したまま、10 kb以上のターゲットに対しても伸長時間10 sec./ kbでの高速PCRを実現しました。ロングリード解析向けの長鎖ターゲット増幅に最適なPCR試薬であり、高い成功率を誇ります。クルードサンプルからの増幅にも対応可能です。
本製品はPolymerase活性と3'→5'Exonuclease活性を抑える2種類のモノクローナル抗体が混合されており、特異性の高いHot start PCR を行うことができます。

特長

● ロングリード解析向けの長鎖ターゲット増幅に最適
ヒトゲノムDNAをテンプレートとして50 kb程度の増幅が可能になっております。長いターゲットでも迅速に、かつ正確に増幅することができるため、ロングリードシーケンスでの鋳型増幅に最適です。

● 高速PCR
1 ~10 kbのターゲットにおいて伸長時間1 kbあたり5 sec.での増幅が可能です。10 kb以上のターゲットに対しても伸長時間10 sec./ kbでの高速PCRを実現し、PCRの反応時間を大幅に短縮することができます。伸長時間を長めに設定することもできるため、同一サイクルでさまざまな長さのターゲットを増幅することが可能です。

● 高い正確性
Taq DNA polymeraseの約80倍の正確性(KOD -Plus-シリーズと同等)を示します。増幅産物はクローニングをはじめ、さまざまな用途に用いることが可能です。

● GC-rich、AT-richなターゲットでも増幅が可能
ターゲットの配列に依存することなく、増幅が可能です。本製品は、低バイアスかつ、高速な増幅が可能なため、Longリードのライブラリー増幅にも最適です。

● クルードサンプルからの増幅が可能
伸長アクセラレーターの添加により、確実性が向上しています。PCR阻害物質を含むクルードなサンプル(生体試料、土壌、食品など)から核酸を精製することなく、目的遺伝子を増幅することが可能です。

実施例

1. ⾼速PCRによる⻑鎖ターゲット(〜47.5 kb)の増幅

KOD Long PCR Master Mixを⽤いて、ヒトゲノムDNAをテンプレートとして1〜47.5 kbのターゲットの増幅を実施しました。
その結果、本製品では47.5 kbまでの⻑鎖ターゲットの増幅もすべて確認することができました。

2. PCR産物のロングリード解析

実施例1で増幅した47.5kbのPCR産物を精製、Ligation sequencing DNA V14(Code. SQK-LSK114;Oxford Nanopore Technologies)を⽤いて推奨プロトコールに従ってロングリード解析⽤ライブラリーを作製しました。
得られたライブラリーは、Flongle™ Flow Cell(R10.4.1)(Code. FLO-FLG114; Oxford Nanopore Technologies)でロングリード解析を⾏いました。
その結果、47.5kbの全⻑にわたるリードが得られ、⽬的の配列がきちんと増幅できていることが確認できました。

PCR試薬選択ガイド

製品内容

【KML-101】
Master Mix

1mL×5本

基本反応条件

(μL)

滅菌蒸留水
KOD Long PCR Master Mix
Primer(5μM each)
Template DNA
Genomic DNA ～200ng
Plasmid DNA ～50ng
cDNA(RNA相当量)　～750ng
生体試料・粗抽出液～5μL

X
25
1.5
Y

Total Volume

<3ステップサイクル>
94℃, 1min.
↓
98℃, 10sec.
Tm-5℃, 5sec.
68℃, 5～10sec./kb　25〜45 cycles

伸長時間は、ターゲット鎖長に応じて以下のように設定してください。
1～10 kb:5 sec./ kb
10 kb～:10 sec./ kb

<2ステップサイクル>
94℃, 1min.
↓
98℃, 10sec.
68℃, 5～10sec./kb　25〜45 cycles

伸長時間は、ターゲット鎖長に応じて以下のように設定してください。
1～10 kb:5 sec./ kb
10 kb～:10 sec./ kb

ワンポイントアドバイス: ●保存について
凍結融解の繰り返しは、20回程度では品質に影響がないことが確認されています。
短期間(1か月以内)であれば、2～8℃で保存可能です。

●プライマーについて
可能な限り、25～35mer程度(Tm値>65℃)をご使用ください。
GC含量を45～60%として、5’側の半分は60～70%, 3’側の半分は40～50%のGC含量になるように設計することで特異性を高めることができます。

※プライマーのTm値の計算は、最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いております。プライマーのTm値計算表(EXCEL)は、こちらからダウンロードできます。イノシンを含むプライマーのTm値はこの方法では計算できません。

トラブルシューティングは
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