One Step RT-PCRキット
RT-PCR Quick Master Mix
TOYOBO
価格表
用途
●RT-PCR
説明
本品は、rTth DNA Polymerase を使用した、1酵素・1-step系のRT-PCRキットです。ホットスタートにも対応し、より高感度な検出が可能となりました。
Tth DNA polymeraseはMn2+存在下で、逆転写活性を示すユニークな酵素であり、本酵素を用いることで同一チューブ内でcDNA合成反応とPCRを連続的に行うことができ、さまざまな用途にご使用になれます。
実施例
1. 当社従来品との感度比較
ヒトG3PDH mRNA*とプライマーセットを使用し、約450bpの領域を標的としたRT-PCRを行いました。
RT-PCR Quick Master Mixは、当社従来品と比べて2桁以上の高感度を示しました。
B: ブランク反応
【サンプル】ヒトG3PDH mRNA* (106 ~ 102コピー/50μl反応系)
*in vivo transcriptionにて調製しました。
【プライマー】
Primer(F): 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (20mer)
Primer(R): 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (20mer)
【サイクル条件】
90℃ 0:30 →60℃ 30:00 →94℃ 1:00
→ (94℃ 0:30 → 60℃ 0:30 → 72℃ 1:00) x 40サイクル
→72℃ 1:00
2. mRNAを用いたcdc2遺伝子の検出
ヒト培養細胞由来mRNA(5ng、0.5ng)を鋳型とし、ヒトcdc2のORF全長(約900bp)をターゲットとしたRT-PCRを行いました。
cdc2はセルサイクルに関わるタンパク質をコードしています。
その結果、当社従来品では検出できなかったターゲットが、RT-PCR Quick Master Mixによる反応では良好な増幅を示すことが分かりました。
【プライマー】
Cdc2-F : 5'-CCATACCATTGACTAACTATGGAAGAT-3' (27mer)
Cdc2-R : 5'-GTCAGAAAGCTACATCTTCTTAATCTG -3' (27mer)
【サイクル条件】
90℃ 0:30 →60℃ 30:00 →94℃ 1:00
→(94℃ 0:30 → 60℃ 0:30 → 72℃ 1:00) x 40サイクル
→72℃ 1:00
参考文献
- 製品内容
【PCR-311】 2XRT-PCR Quick Master Mix 625μL×2本 50mM Mn(OAc)2 200μL×1本 Nuclease-free Water 1100μL×1本 Positive Control RNA 50μL×1本 Control Primer F 50μL(10pmoles/μL)×1本 Control Primer R 50μL(10pmoles/μL)×1本 【PCR-311F】 2XRT-PCR Quick Master Mix 625μL×2本 50mM Mn(OAc)2 200μL×1本 Nuclease-free Water 1100μL×1本
- 注意事項
- 基本反応条件
滅菌蒸留水 XμL
2×Master Mix 25μL
50mM Mn(0Ac)2 2.5μL
各Primer 10pmoles each
RNAサンプル
Total RNA <2.5μg
Poly(A)+ RNA < 500 ng
Total Volume 50μL
Cycle
90℃, 30sec.
60℃, 30min.
↓
94℃, 1min.
↓
94℃, 30sec.
50～70℃ 30sec. 30～40Cycles
72℃, 1min.
↓
72℃, 7min.
※アニーリング温度は、プライマーのTm値などを考えて、50～70℃の間で調整します。
- ワンポイントアドバイス
●ゲノムDNAのコンタミネーションについて
あらかじめ、DNase処理を行いゲノムを除去するか、下記のA, Bの方法でプライマー設計をすることで、ゲノムの影響を回避できます。
A. イントロンを挟むようなプライマー→PCR産物の長さで区別する。
B. 2つのイントロンにまたがるようなプライマー→PCR産物ができないようにする。
●逆転写反応時のプライマーについて
PCR用のReverse Primerがそのまま逆転写用のプライマーとなります。
別途添加する必要はありません。また、Oligo dTやRandom Primerは使用できません。
●RT-PCR産物のクローニング
本キットではMn2+の存在下でPCRを行うため、Mg2+を用いる通常のPCRに比べさらに正確性が低下する傾向にあります。よって本製品は、クローニング用でのPCRには適しません。
※プライマーのTm値の計算は、最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いております。プライマーのTm値計算表(EXCEL)は、こちらからダウンロードいただけます。イノシンを含むプライマーのTm値はこの方法では計算できません。
トラブルシューティングは
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English Page
- ※ 法規制について
- 毒： 毒物及び劇物取締法[医薬用外毒物]
- 国： 国民保護法[毒素]
- 劇： 毒物及び劇物取締法[医薬用外劇物]
- 組： カルタヘナ法(遺伝子組換え生物等の使用等の規制による
- 危： 消防法[危険物]
- 生物の多様性の確保に関する法律）
- Ｐ： PRTR法（化学物質排出把握管理促進法）[届け出義務物質]
- 申： ご購入時に申込書の提出が必要な製品
- 労： 労働安全衛生法[通知または表示義務物質]
- なし： 上記法令や申込書の提出に該当しない製品
