プローブ検出用リアルタイムPCR Kit Hot Start TTx (DNA) Kit

価格表

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
HSTTX-101 250回用
(20μL反応)
¥24,000 -20℃ 取扱説明書 データシート SDS 該当無し

用途

●リアルタイムPCR

説明

本試薬は、弊社独自の酵素である TTx DNA Polymerase を使用した リアルタイムPCR 試薬です。


TTx DNA Polymerase は、汎用酵素である Taq DNA Polymerase と比べ増幅効率が高く、高速サイクルでの PCR や PCR 阻害物質を含むクルードサンプルからの増幅が可能です。


TTx DNA Polymerase は、5’→3’Exonuclease活性を有するため、TaqMan®アッセイなどのプローブアッセイを用い たリアルタイム PCR にご使用になれます。本試薬には、中和抗体が混合されており、特異性の高い Hot start PCR を行うことができます。

特長

●優れたDNA増幅効率
弊社独自の酵素であるTTx DNA Polymerase をベースに反応組成を最適化しました。TTx DNA Polymerase は汎用酵素であるTaq DNA Polymerase やTth DNA Polymerase に比べ伸長性が高く、効率的な増幅が可能です。

●高速サイクルで検出可能
高い増幅効率を活かし、短時間の反応サイクルでも効率的な増幅が可能です。

●クルードサンプルに強い
PCR 阻害物質を含むクルードなサンプル(生体試料、土壌、食品など)からの増幅に優れます。血液などでは、核酸を抽出することなく直接反応液に加えるだけで十分な増幅が可能です。

マルチプレックスPCRが可能
検出波長の異なるTaqMan® probeを使用することで、複数のターゲットを同時に検出することが可能です。同一反応内でコントロール遺伝子と標的遺伝子を検出することができ、迅速、簡便に正確性の高い遺伝子定量が可能です。

●dUTP 含有
本試薬の2×Buffer for rTth/ TTx (DNA) 中にはdUTP が含まれています。Uracil-N-Glycosylase(UNG)*を添加することで、キャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができます。
* 本キットにUNG は含まれません。別売りのUracil-DNA Glycosylase (UNG), Heat-labile [UNG-101]をご使用になれます。

●高速ホットスタート
抗DNAポリメラーゼ抗体を用いたホットスタートシステムを採用しています。抗体を用いたホットスタートは非特異反応の抑制に強力な効果を示し、また、加熱によって速やかに抗体が失活するため、酵素の再活性化も迅速であり、酵素への高温によるダメージを最小限に抑えることができます。

実施例

1.百日咳菌IS481遺伝子およびヒトG6PDH遺伝子の検出

百日咳菌DNA(150,000, 3,000, 600, 120, 24, 5, 1コピー)を鋳型としたIS481遺伝子およびHeLa細胞total RNA由来のcDNAの5倍希釈(4段階)を鋳型としたG6PDH遺伝子の増幅を、TaqMan® Probeを用いてHot Start TTx(DNA) KitおよびTaq DNA PolymeraseをベースとしたリアルタイムPCR試薬にて行いました。その結果、いずれのターゲットにおいてもHot Start TTx(DNA) Kitで、効率的な増幅を得ることができました。




 

2.高速サイクルでのリアルタイムPCR

Hot Start TTx(DNA) KitおよびTaq DNA Polymeraseをベースとした
リアルタイムPCR試薬にて、TaqMan® Probeを用いてアフリカ豚コレラ
ウイルスDNAの増幅を高速サイクルで行いました。
その結果、Hot Start TTx(DNA) Kitのみ高速サイクル条件下で効率的な
増幅が可能でした。

    サイクル条件
   95℃   2min.    
   95℃   1sec.   50 cycles
   60℃   1sec.
    装置    
   Roche LightCycler®96


 

3.血漿を添加した場合の増幅への影響

Hot Start TTx(DNA) KitおよびTaq DNA PolymeraseをベースとしたリアルタイムPCR試薬にて、TaqMan® Probeを用いてアフリカ豚コレラウイルスのDNAの検出を実施しました。
20μLの反応液に2.5μLの血漿ありなしで反応を比較した結果、Taq DNA Polymeraseベースの試薬では血漿の阻害を受け、増幅が確認できませんでした。一方、本試薬においては、血漿の阻害を受けることなく増幅が可能でした。


                                    *増幅がみられなかったものはCt=40としました。
 

4.マルチプレックスPCRによる腸内細菌の検出

Hot Start TTx(DNA) KitおよびTaq DNA PolymeraseをベースとしたリアルタイムPCR試薬にサルモネラ・赤痢菌・O157の検出用プライマー・TaqMan® Probeを混合し、各遺伝子(1,000、250、63、15コピー)の検出をマルチプレックスPCRにて行いました。また試薬には、あらかじめ内部標準として、鋳型および検出用プライマー・プローブを添加しました。その結果、Taq DNA Polymeraseベースの試薬では検出困難でしたが、Hot Start TTx (DNA) Kitでは、3種類のターゲットがすべて検出可能でした。

製品内容
2×Buffer for rTth/TTx (DNA)
  1.25mL×2本
Hot Start TTx DNA Polymerase
(4U/ μL) 62.5μL×1本

 

活性の定義:
75℃活性測定条件で30分間に10nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量を1Uとします。

基本反応条件
  (μL)
滅菌蒸留水  X
2×Buffer for rTth/TTx (DNA)* 10
10μM Primer F   0.6
10μM Primer R   0.6
TaqMan® Probe  0.4
Hot Start TTx DNA Polymerase  0.25
(Uracil-N-Glycosylase) (0.4unit)
Sample  Y
Total Volume 20

Applied Biosystems社製機器やAgilent Technologies社製機器などでウェル間の蛍光強度および分注誤差補正のためパッシブリファレンスを使用する場合は、別売品である50× ROX reference dye[Code No. ROX-101]をお使いください。 

*dTTPの代わりにdUTPが含まれています。


95℃    1min.    
95℃   15sec.  40~50 cycles
60℃   30sec.

UNG処理を行う場合は、Predenature反応の前に、UNG反応のステップを設定してください。UNGの反応は各社の推奨条件に従って調整してください。

備考

本製品は、Chakrabarti Advanced Technology NewCo LLC.よりUS7772383のライセンスを受け、販売しております。

TaqMan®, LightCycler® は、Roche Diagnostics K.K.の登録商標です。

ワンポイントアドバイス

プライマーの添加量は各々最終濃度0.2-0.6μM、TaqMan®Probeの添加量は最終濃度0.05-0.3μMを目安にご検討ください。増幅効率がよくない場合、添加量を増やすことによりパフォーマンスが向上する場合がありますが、逆に入れすぎると非特異反応の原因となり、検出感度が低下する場合があります。


高速サイクルやクルードサンプルからの検出において、増幅効率がよくない場合、酵素量を増やす(最大2倍量)ことにより改善する場合があります。

Annealing/ Extension の温度は、55~65℃の範囲で検討いただくと検出感度等が改善する場合があります。

リアルタイムPCR装置によっては、高速サイクルでの増幅が可能です。Denature時間を最短1秒、Annealing/Extension時間を最短1秒で検出できる場合もありますので、DenatureおよびAnnealing/Extension時間をご検討ください。

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データシート
SDS 法規制※1
50×ROX reference dye ROX-101 5mL×1本 ¥30,000 -20℃ SDS 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。