KOD -Plus- Mutagenesis Kit

KOD -Plus-の高い正確性を活かした、インバース PCR(Inverse PCR)法に基づく部位特異的変異導入キットです。

本方法では、プラスミドDNAを鋳型として背中合わせに設計したプライマーを用いてプラスミド全周を増幅し、変異導入を行います。

●幅広い変異導入に対応
通常の変異導入に加え、数10bpの挿入(Tagの挿入)や数100bpの欠失にも対応可能です。また、混合塩基を導入したアミノ酸点変異ライブラリーの作製などにも応用可能です。

●確実な変異導入
最大95%の変異導入効率が得られます。また、PCRエラーによる2nd-site mutation(目的とする変異以外の変異)の可能性を最小限にしています。最大で11kbのプラスミドで変異導入を確認済みです。

●簡便なプロトコール
形質転換まで3ステップの簡単なプロトコールになっています。また、リン酸化したプライマーを準備する必要はありません。

本キットでは、以下の手順に従って、変異導入を行います。

①Plasmid DNAを鋳型に、変異を導入したプライマーを用いてインバース PCR(Inverse PCR)を行います。欠失変異体を取得したい場合には、その欠失させたい領域の外側にプライマーを設計します。

②PCR産物に制限酵素Dpn Iを加え、鋳型Plasmidを消化します。
(Dpn Iは、認識サイト(GATC)中のアデニンがメチル化されている時のみ切断を行います。よって、一般的なDamメチラーゼ(+)の大腸菌株(JM109やDH5αなど)から調製した鋳型プラスミドはメチル化されているためDpn Iにより切断を受け、断片化されます。一方、PCR産物はメチル化されていないため、認識サイト(GATC)が存在しても切断されません。)

③直鎖状プラスミドであるPCR産物をSelf-ligationすることにより環状化し、大腸菌の形質転換に供します。

1.欠失および挿入変異における効率比較
7.3kbのプラスミドFLJ32066を対象に、本製品と、A社non-PCR法キットを用いて90塩基の欠失、および6xHisに対応する18塩基の導入を行いました。その結果、他社のキットが苦手とするような欠失や挿入などの変異導入に対しても、本製品では高い効率で変異体を取得することができました。

●90bp欠失

●18bp挿入

2. 目的外変異(2nd-site mutation)の挿入頻度の評価
キット付属のコントロールプラスミド(4.3kb)を鋳型として変異導入を行い(PCRは8サイクルにて実施)、得られた変異体から24クローンについて各々2,000bpの領域のシーケンシングを行いました。その結果、本製品では、実際に解析した合計48,000塩基の内、目的以外の変異はわずか1塩基でした。これは、A社non-PCR法キットと比較しても、同等以上の結果でした。

実施例3:種々のサイズのプラスミドをターゲットとした場合の変異導入効率の評価

(1)S. Arai et al., FEBS Letters, 581(29): 5649-5657(2007)
(2)Y. Torisu et al., Cancer Science,99(6): 1139-1146(2008)
(3)N. Shinmen et al., FEBS Letters.583(12): 1916-1922(2009)