コーヒーブレイク

■はじめに
イルミナ社次世代シーケンサー(NGS)でDNAを解析する際には、解析したいDNAをNGS機器の読み取りに合わせた長さに調製し、シーケンスに必要な配列を付加する必要があります。
DNAのライブラリー調製では、以下の図のような反応を進めていくことで、シーケンスに必要な配列が付加されたライブラリーが調製されます。
解析に利用するDNA量が少ない場合は、ライブラリーの収量を増やすため、PCRの工程が必要となります。



ライブラリー調製のポイントとして、ライブラリーが得られることはもちろんのことですが、PCRでライブラリーを増幅する際は、特異的に、かつバイアスなく増幅できることがNGSデータの質の面で重要となってきます。

今回は、高い正確性・増幅効率をもつ改変型KOD DNAポリメラーゼを採用している「GenNext® NGS Library Prep Kit」を使用して、PCRフリーで調製したライブラリーとPCR増幅で調製したライブラリーを比較してみました。


■実験方法
GenNext^® NGS Library Prep Kit(Code No.LPK-101)とA社ライブラリー調製キットを用いて、断片化した大腸菌ゲノム1μgからPCRフリーで調製したライブラリーと、断片化した大腸菌ゲノム1ngからPCR増幅(12サイクル)で調製したライブラリーをNGS解析しました。
ライブラリーデータはリード数を等しくするためダウンサンプリングを行い、各サンプル100万リードに揃えて、マッピング率を比較しました。


■結果

GenNext^®NGS Library Prep Kitでは、A社の試薬と比較して良好なマッピング率を示しました。また、PCR増幅したライブラリーでも、PCRフリーに近い値を示し、特異的な増幅を示す結果となりました。


■さいごに
本キットは生物の全ゲノム解析だけでなく、CHIP-seqやPCR産物のNGS解析といった用途にもご利用いただけます。
今回使用した製品をご紹介します。

イルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリー調製キット
GenNext^® NGS Library Prep Kit


●簡便かつ迅速な操作フロー
末端修復および3’末端のアデニル化からアダプターライゲーションまでの工程を同一容器内で行うことができます。末端修復および3’末端のアデニル化は15分、アダプターのライゲーションは15分で実施可能です。ライブラリー増幅はアニーリング10秒、伸長15秒のサイクルで実施できます。

●広範囲のインプット量
広範囲のインプット量(1ng - 1μg)に対応するように設計されています。

●低バイアスのライブラリー増幅
ライブラリーの増幅に使用するLibrary Amplification Master Mixには遺伝子改変型KOD DNA polymeraseを用いて開発された高正確性PCR用酵素が使用されています。GCの偏りによる増幅への影響を最小限に抑えており、さまざまな領域を均一に増幅することが可能です。


* GenNext^® は、東洋紡株式会社の登録商標です。