実施例

KOD FX Neo 実施例9 ES細胞での遺伝子組換え判定

 【データご提供】
  群馬大学先端科学研究指導者育成ユニット
  山本正道 先生

【サンプル】ES細胞のゲノムDNA

【サンプルの処理】
  ES細胞をProKにて溶解した後、フェノール/クロロフォルム→クロロフォルム→イソプロパノール沈殿を行った後にTE溶液にて溶解した。

【遺伝子名】ROSA26領域に特定のcDNAをknock-inしている

【ターゲット長】7,011bp

【反応条件】
  DW                                      　 11-X  μL
  2×Buffer  for KOD FX Neo    25   μL
  2mM dNTPs                           10   μL
  10 pmol/ml  Primer F              1.5 μL
  10 pmol/ml  Primer R              1.5 μL
  Template DNA                  　    X    μL
  KOD FX                          　        1    μL　　　　
　　　　　　　　　　            50  μL

【PCRサイクル】

※その他の試薬においては、取扱説明書に従い最適な条件にて実施した。

【コメント】
　KOD FX Neoを用いた場合は通常のPCR条件(3-step cycle)でも検出可能だが、step-downのPCR条件にするとはっきりと検出可能である。対してA社高効率PCR酵素を用いた場合、今回は検出可能であったが、検出できる場合とできない場合がある。これはDNA量と酵素量に依存する感触を持っている。A社高効率PCR酵素は推奨量よりも2.5倍程度増量すると検出可能になるようである。A社Long PCR酵素では全く検出できない。


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