実施例
Can Get Signal 実施例10
CATAROSEVで回収した細胞外小胞(EV)のウェスタンブロット解析
HEK293細胞培養上清由来の細胞外小胞(Extracellular Vesicles:EV)を、CATAROSEV®[Code No. CTS-001]および超遠心法(UC)で回収し、EVマーカーであるTSG101のウェスタンブロット(WB)解析を実施しました。
また、抗原抗体反応促進試薬であるCan Get Signal®Immunoreaction Enhancer Solution[Code No. NKB-101]を用い、TSG101の検出感度への影響を評価しました。
EVの回収はCATAROSEV®の取扱説明書および一般的な超遠心法に従って実施し、得られたEVは以下の方法でウェスタンブロッティングト解析に使用しました。
【EV回収条件】
・試料
HEK293細胞培養上清 10 mL
・CATAROSEV®
培養上清10 mLを処理し、溶出液2 mLで回収し、170 μL(EV 約4.4×10^8 particles相当)をエタノール沈殿法により濃縮後使用
・超遠心法(UC)
培養上清10 mLを処理し、沈渣を2 mLのBufferで懸濁し、170 μL(EV 約3.5×10^8 particles相当)をエタノール沈殿法により濃縮後使用
【EV濃縮条件】
回収したEVサンプルはエタノール沈殿法により濃縮。
サンプル(170 μL)に対して4℃に冷やした4倍量のエタノールを添加し、ボルテックス後、-20℃で60分間静置。続いて、4℃、13,000×gで20分間遠心し、上清を除去。
得られた沈殿は室温で30分程度静置し、残存するエタノールを揮発除去した後、1×SDS-PAGE用試料Bufferで再溶解し、95℃で5分間熱処理を実施。
調製したサンプルを用いてSDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析を実施。
【ウェスタンブロット条件】
・一次抗体
抗TSG101モノクローナル抗体(1,000倍希釈)
・二次抗体
HRP標識抗Rabbit IgG抗体(2,000倍希釈)
・露出時間
2分
・比較条件
他社ブロッキング試薬
Can Get Signal® [Code No. NKB-101]
【結果】
図1. HEK293細胞培養上清から回収したEVのTSG101ウェスタンブロット解析
CTS:CATAROSEV®で回収したEV
超遠心:超遠心法で回収したEV
HEK:HEK培養上清(精製前)
左:他社ブロッキング試薬使用
右:Can Get Signal®[Code No. NKB-101]使用
CATAROSEV®および超遠心法の両サンプルでTSG101が検出され、CATAROSEV®回収サンプルは超遠心法回収サンプルよりも強いTSG101シグナルを示しました。
さらに、Can Get Signal®[Code No. NKB-101]を使用した場合、露出時間2分の条件においてCATAROSEV®および超遠心法の両サンプルで明瞭なTSG101バンドが確認されました。一方、他社ブロッキング試薬ではバンドは非常に弱く、Can Get Signal®[Code No. NKB-101]の使用により検出感度が向上することが確認されました。
