実施例
Shin-RamDA-seq 実施例4 FFPEからのNGS解析
1ngのFFPE由来のRNAから、GenNext® Shin-RamDA-seq® Single Cell Stranded Kit [Code No. RML-101]を用いて、ライブラリー調製を行い、RNA-Seqを行いました。RNA-Seqにはイルミナ社MiSeq®を使用しました。使用したFFPE、RNA-Seqの解析条件は以下の通りです。
| 項目 | 使用条件 |
| FFPE検体 | Horizon社5-Fusion Multiplex (Negative Control) Catalog ID:HD783 |
| RNA精製条件 | Qiagen社RNeasy FFPE Kitで精製 |
| RNA量 | 1 ng |
| RIN | 3.6 |
| DV200 | 70-80% |
| ライブラリー調製 | GenNext® Shin-RamDA-seq® Single Cell Stranded Kit |
| プライマー条件 | ランダムプライマー(n=4)またはNSRプライマー(n=4) |
| NGS解析 | basespace (illumina)のRNA-Seq Alignment (ver. 2.0.2)、 またはRamDAQ (ver.1.9.1.)で解析 |
| 解析項目 | basespace:マッピング率、アバンダント率、ストランド率 RamDAQ:検出遺伝子数、検出転写産物数 |
各解析項目は、以下のような結果となり、 GenNext® Shin-RamDA-seq® Single Cell Stranded Kit を使用することで1万以上の遺伝子を検出することができました。さらに18S, 28S RNA遺伝子に完全にマッチする配列を計算上除外したランダムプライマーであるNSRプライマー[Code No. NSR-101]を併用することでrRNAの検出を抑え、より高精度での解析が可能でした。
| ランダムプライマー | NSRプライマー | |
| マッピング率 | 90%程度 | 90%程度 |
| アバンダント率 | 60-70% | 30-40% |
| ストランド解析率 | 95%程度 | 95%程度 |
| 検出遺伝子数 | 12,000-13,000種 | 14,000-15,000種 |
| 検出転写産物数 | 22,000-23,000種 | 27,000-28,500種 |
FFPE由来のRNAは分解が激しく、検体によってはRNAが十分に得られないことがあり、解析が難しいものとされています。実際、1ngといった微量RNAから、1万遺伝子以上を検出できるFFPE解析手法はほとんどありません。
GenNext® Shin-RamDA-seq® Single Cell Stranded Kit では、微量なRNAからでもランダムプライマーを用いて、バイアスなく遺伝子を検出可能で、他の解析手法と比べ、多くの遺伝子情報を得ることが可能になります。
分解が考えられるRNAや微量RNAを解析したい方は、ぜひ一度、 本製品をご評価ください。
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