実施例

QuantAccuracy 実施例4 FFPE標本由来のRNAからの増幅

本製品、D社、E社 cDNA増幅試薬、および増幅能のないF社逆転写試薬を用いて、ヒトFFPE検体由来精製RNA(100pg、1ng)よりcDNAを合成し、2種の核内RNA遺伝子(NEAT1、MALAT1)および8種のハウスキーピング遺伝子(ACTB、GAPDH、ATP5F1A、YWHAZ、PPIA、B2M、RPS18、HPRT1) の検出・定量解析を行いました。リアルタイムPCR試薬には、弊社THUNDERBIRD^® SYBR™ qPCR Mix [Code No. QPS-201] を用い、20μL反応系にcDNA溶液 1μLをインプットしました(n=6)。

まず、100pgのRNAからの各遺伝子の検出率を比較しました。その結果、いずれの遺伝子においても本製品を用いた場合、最も高い検出率が示されました(右上表)。

続いて、異なるRNA量(100pg、1ng)を鋳型としてcDNAを合成し、リアルタイムPCRにより増幅を行い、Ct値の比較を行いました。 100pgのRNAを用いた場合のCt値と1ngのRNAを用いた場合のCt値を直線で結んだところ、本製品を用いた場合のみ、平行となり、解析における増幅率のバラつきがほとんどありませんでした(下図)。また、本製品の100pgと1ngの間でのΔCt値をとり、その平均を求めると、約3.40となりました。つまり、本製品を用いた解析では、10倍のサンプル量の差を2^3.40≒10.6倍の遺伝子量の差として評価しており、FFPE標本由来のRNAにおいても、増幅率のバイアスが少なく解析が可能と考えられました。



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