コーヒーブレイク

■はじめに
皆さんはPrimerをどのくらいの長さで設計していますか?
配列はもちろん、長さもPrimerを設計する上で重要なポイントですよね。
今回は、Long PCRでPrimerの長さを2merずつ変えて、どの長さが一番KODにぴったりなのか検証してみました!


■実験方法
40merから18merまで2base刻みで長さを変化させたPrimerを用いて、ヒトゲノムβ-globin領域の17.5kbをターゲットとし、KOD FXを使用してPCRを行いました。


2×PCR buffer for KOD FX                  25 μL
2mM dNTPs                                        10 μL
10pmoles/μL Primer F                      1.5 μL
10pmoles/μL Primer R                     1.5 μL
Human Genomic DNA(50ng/μL)        1 μL
KOD FX(1.0U/μL)                                  1 μL
Autoclaved, distilled water      up to 50 μL

使用Primer一覧


 

2step
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
68℃, 18min.
30cycles

■結果

                 



Long PCRでKODにぴったりなPrimer長は、「40~24mer」という結果でした!

また、同時に出現したエキストラバンドはPrimer長が長い程少ない傾向にあることが分かりました。
Long PCRでは、通常より長めにPrimerを設計し特異性を上げると共に、アニーリング(及び伸長反応)を比較的高い温度に設定することでより良い結果が得られそうです!


■さいごに

今回使用したKOD FXをはじめとするKODシリーズの最新製品はこちら

KOD One^® PCR Master Mixシリーズ
高い正確性・増幅効率をもつ改変型KOD DNA polymeraseを用いたPCR用2×マスターミックスです。
優れた正確性と簡便さを持ち、高速PCRが可能です。