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PCR/RT-PCRのご質問【Blend Taq/ Blend Taq -Pus-】

Blend Taq はどんな酵素ですか?開 く閉じる

Barnesらの方法をベースに開発された、高性能Taq DNA polymeraseです。Taq DNA polymeraseに

3'→5'エキソヌクレアーゼ活性(校正活性)を有するDNAポリメラーゼが微量混合(Blend)することにより、

増幅効率、伸長性に優れたPCRを行うことができるよう調製されています。

(Barnes, W. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2216-2220 (1994))

正確性はTaq DNA polymeraseの3〜4倍で、通常の条件でTAクローニング可能です。
 

Blend Taq とBlend Taq -Plus-はどのように使い分けたら良いですか?開 く閉じる

Blend Taq® -Plus-には、常温でTaq DNA polymeraseの活性を抑制するため、抗Taq抗体が混合され

ています。この抗体はサンプル調製時に生じる副反応を抑えます。この抗体は、1回のPCRサイクルで

不活性化されますので、PCR反応は阻害しません(ホットスタート)。よって、Blend Taq ® -Plus-の方が、

より特異性高い高性能な増幅が可能です。 
 

正確性はどのくらいですか?開 く閉じる

Taq DNA Polymeraseに対して、約3~4倍正確性が高いことを確認しています。

 

増幅できるターゲット長はどのくらいですか?開 く閉じる

Human β‐globin gene 23.0Kbでの増幅を確認しております。
詳細はこちらをご覧ください。

 

サイクリング条件をどのように設定したら良ですか?開 く閉じる

下記の条件をお薦めいたします。
 

 ステップ   ターゲット長  サイクル数
 <1kb  1kb〜6kb  >6kb
 1 変性    94℃、2分  1
 2 変性    94℃、30秒※1  30
 3 アニーリング  プライマーTm値-5℃
(55〜60℃)、30秒
 68℃、1分/kb
ターゲット※2・3
 4 伸長  72℃、1分 72℃、1分/kb
PCRターゲット


※1:94℃ 25〜30秒または 98℃ 5〜10秒の範囲をお勧めいたします。
※2:プライマーのTm値は70℃以上になる様に設計願います。
※3:ターゲット長が10kbを越える場合、0.3〜0.4mMのdNTPの濃度でPCRを行なってください。

詳細はこちらの記事をご参照ください。

 

増幅できる鋳型の量はどのくらいからですか?開 く閉じる

5ngのヒトゲノムDNAでの増幅を確認しています。 
 

PCR産物のTAクローニングは可能ですか?開 く閉じる

原理上平滑末端の産物も若干混ざりますが、Taq DNA polymerase とほぼ同等の効率でTAクローニング

できることを確認しています。
TAクローニングには高効率TAクローニングキット「TArget CloneTM」をお薦めします。

 

コロニーダイレクトPCRに用いることは可能ですか?開 く閉じる

可能です。こちらの実施例をご覧ください。

 

増幅結果にバラツキがみられるのですが、どうしたら良いですか?開 く閉じる

伸長時間を長くする、アニーリング温度を下げる等の検討を行ってください。
また、もしBlend Taq® をお使いならば、Blend Taq® -Plus-のご使用をお勧めします。
Blend Taq® -Plus-には、抗Taq DNA polymeraseが混合されており、ホットスタート法により更に

特異性の高いPCRを行うことができます。
条件に関してはこちらをご覧ください。