KOD FX 実施例36
コロニーPCRによる各種細菌DNAの検出

A. 嫌気性腸内細菌の検出


B. 代表的なグラム陽性細菌の検出


C. 腸管出血性大腸菌O157と他の大腸菌の検出


サンプル

●実験A
嫌気性の腸内細菌(Bacteroides fragilis ATCC25285, Bifidobacterium adolescentis GAI1275, Peptostreptococcus magnus GAI5528, Lactobacillus acidophilus GAI1132)のコロニー
●実験B
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Salmonella enteritidisのコロニー
●実験C
腸管出血性大腸菌の変異株GPU995、大腸菌K-12株のC600、臨床分離株の大腸菌Nagoyaのコロニー

サンプルの処理

●実験A
嫌気ステーション内でGAM培地上に増殖したコロニーをピペットチップの先に取り、PBSに懸濁して、そのチップを直接、反応液に浸けて懸濁。
●実験B
LB培地上に増殖したコロニーをマイクロピペッターのチップの先で触れ、PBSに懸濁し、そのチップを直接PCR反応液に浸けて懸濁。
●実験C
LB培地上に増殖したコロニーを直接ピペットチップの先に取り、反応液に懸濁。

遺伝子名・ターゲット長

●実験A
ssu (16S rDNA遺伝子), 約1kb
●実験B
16S rDNA遺伝子, 約1kb
●実験C
espA (TypeIII分泌装置の一部), ssu (16S rDNA遺伝子)、それぞれ約600bpと約1kb

反応液組成

●実験A
バッファー10μL + dNTP 4μL + 水 5μL + プライマー0.3+0.3 μL(1.5 μM) + 酵素 0.4μL
※A社酵素も同じ組成
●実験B
バッファー 10μL + dNTP 4μL + 水 5 μL + プライマー 0.3 + 0.3μL (1.5 μM) + 酵素 0.4μL
※A社酵素も同じ組成
●実験C
バッファー10μL + dNTP 4μL + 水 4.8μL + プライマー0.4 + 0.4μL (1.5 μM) + 酵素 0.4μL
※A社酵素も同じ組成

PCRサイクル条件

96℃, 2 min.

(95℃ 30sec.,   50℃  30sec.,   72℃ 1min.) × 40 cycles

※A社PCR酵素も同じサイクル

コメント・ご意見


●実験A
菌種によってPCRのかかり具合が違うが、KOD FXのほうが効率よく増幅されているようです。

●実験B
いずれも増幅できたが、KOD FXは増幅効率がよい。セラチアではスメアになりにくく、特異的なバンドがはっきりした。

●実験C
O157とそうでない大腸菌を区別できました。どちらもほぼ同様に増幅できましたが、KOD FXのほうがやや特異性の高い反応条件であったようです。

データご提供

岐阜薬科大学微生物学研究室
吉田朋未 様、高橋圭太 様、後藤麻美 様、杉山剛志 先生


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