(KOD FX) 実施例38

 KOD FXは、クルードサンプルからの増幅効率に優れた高成功率PCR酵素です。以下に、先生方からいただきましたKOD FXの使用例を掲載いたしております。実験にお役立てください。

 

 実施例22:
 
KOD FX を用いた麹菌Aspergillus oryzaeの遺伝子破壊の確認

 

※本実施例は、第61回 日本生物工学会大会(2009)にて発表されたものです。

            20100209picture_1.jpg

【背景】

麹菌の遺伝子破壊を行った際の確認は、従来、DNAの抽出を伴った煩雑なものであった。今回、KOD FXを用い、麹菌の分生胞子を溶液中で加熱しただけのサンプルを用いて増幅を行い遺伝子型の判定を行った。


【サンプル】 麹菌の遺伝子破壊候補株の分生胞子


【サンプルの処理】  ①胞子を微量かぎとりBuffer*(50 μl)に懸濁
                                *Buffer:100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 1 M KCl, 10 mM EDTA

                      ②95℃10分 →Vortex →上清1 μl / 50 μl PCR反応液

 

【遺伝子名】 推定酸性カルボキシペプチダーゼ(ACP)遺伝子

 

【ターゲット長】 3.6~5.2 kb

20100209fig.jpg

 Fig. 1 プライマーの位置と増幅産物のサイズ



【反応液組成】 取り扱い説明書に記載の通り
 

 

 滅菌水  10 <μl>
 2x PCR Buffer for KOD FX  25
 2mM dNTPs  10 (final 0.4mM)
 10 pmol/μl Primer  F  1.5
 10 pmol/μl Primer  R   1.5
 KOD FX (1U/μl)    1
 前処理サンプル溶液  1
 Total  50 μl

 

                                                                                      

【PCRサイクル】

94℃, 2min.
 ↓
[ 98℃, 10sec    68℃, 5min ] (35cycles)
    

【結果】

遺伝子破壊株を明瞭に判定でき、酵素活性が低下していたことから遺伝子の機能を特定できた。

【コメント】

従来、麹菌等、糸状菌はコロニーPCRが困難で、遺伝子破壊株を判定する際、ゲノムDNAを抽出精製する必要があったが本製品を用いることで、その作業が不要となり、容易に多検体のクローンの遺伝子型を調べることが可能になった。


【データご提供】

白鶴酒造株式会社 研究開発室
山下 伸雄 様


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