(KOD FX) 実施例33

KOD FXは、クルードサンプルからの増幅効率に優れた高成功率PCR酵素です。以下に、先生方からいただきましたKOD FXの使用例を掲載いたしております。実験にお役立てください。

 

 実施例17: カビ(Aspergillus oryzae)からのダイレクトPCR

 

20090604fig_2.jpg

【サンプル】
カビ菌体(懸濁液)

【前処理】
懸濁(菌体を直接使用)
<ピペットでカビをかきとり、TEバッファー50 μlに懸濁する>
20090609fig.jpg

【ターゲット】
Aspergillus oryzae amy gene for alpha-amylase 2.1 kb

【プライマー】
F: CCATGCTTGGAGGATAGCAA  (Tm 58.7)
R: CACTGTCCAATGCCAGATTG  (Tm 57.8 )

【反応液組成】
PCR grade water                        7
2×PCR buffer for KOD FX           25 (μl)
2 mM dNTPs                             10
10 pmol/μl Primer F                     1
10 pmol/μl Primer R                     1
KOD FX (1.0 U/μl)                      1    
カビ懸濁液                          5
 Total                                     50      


【PCR サイクル】
94℃ 5 min

(98℃ 10 sec, 55℃ 30 sec, 68℃ 2 min) 35 cycles

4℃∞

※A社高効率PCR酵素は推奨条件を用いて行いました。

【結果】
特別な前処理なしで、良好に増幅することができました。カビのコロニーを直接用いても問題なく増幅できましたが、コロニーを持ち込み過ぎた場合、再現性が得られない場合がありました。そこで、コロニーピックしたものを、TEバッファー50 μl 程度に懸濁し、その5 μlをKOD FXのPCR反応液(総量50 μlの系)に添加したところ再現性よく増幅することができました。


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