(KOD FX) 実施例31

KOD FXは、クルードサンプルからの増幅効率に優れた高成功率PCR酵素です。以下に、先生方からいただきましたKOD FXの使用例を掲載いたしております。実験にお役立てください。

 

 実施例15: マウス尾溶解液からのゲノムDNAの増幅
 ◆実験1.  マウス尾溶解液を用いたPCR効率比較

20090409fig1.jpg
 

 ◆実験2.  プラスミドサンプルを用いたPCR効率比較

20090407fig2.jpg

【サンプル】
実験 1) mouse tail lysed with Proteinase K 0.5μl
実験 2) Plasmid (20ng)

【ターゲット】ターゲット遺伝子名、増幅サイズ
実験 1) pGKneo, 500 bp
実験 2) CAG promoter region + GFP, 3 kb

【プライマー配列】
実験 1) forward, reverse共に20 mer
実験 2) forward, 21 mer; reverse, 29 mer

【反応液組成】
●KOD FX
PCR grade water                   X μl
2x PCR buffer for KOD FX       7.5 μl
2mM dNTPs                         3 μl
10pmol /μl Primer #1             0.45 μl
10pmol /μl Primer #2             0.45 μl
KOD FX (1.0U/μl)                  0.3 μl 
サンプル                  Y μl
-----------------------------------------------     
Total reaction volume            15 μl

※他社品は取説に従い調製を行いました。

【サイクル】
実験 1)
95℃ 2min

(95℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 30 sec) 36 cycles

4 ℃, forever

実験 2)
95℃ 2 min

(98℃ 10 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 3 min) 33 cycles

4 ℃, forever

【データご提供】
高知大学医学部解剖学講座
三井 真一 先生

【先生からのコメント】
 想像以上に増幅効率が高く、驚きました。
 マウステールの処理ですが、以下のように行っています。3~5 mmの長さに切ったマウステールに500 μLのLysis buffer (100 mM Tris-Cl, pH8.5, 5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.2% SDS, 100μg/ml Proteinase K)を加えて56℃で一晩混合する。この溶解液の0.5 μLをテンプレートとして反応液に加えています。Proteinase Kの失活操作はしていません。overnightで処理しているうちに自己分解して失活するようです。経験上、加える液量が過剰であったり、テールの溶解時間が短い(数時間程度;テールは一応溶解しています)とバンドの出方が悪い気がしています。

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