KOD FX 実施例28
マウス尾溶解液からのゲノムDNAの増幅

≪実験1. マウス尾溶解液を用いたPCR効率比較≫



≪実験2. プラスミドサンプルを用いたPCR効率比較≫


【サンプル】
実験 1) mouse tail lysed with Proteinase K 0.5μl
実験 2) Plasmid (20ng)

【ターゲット】ターゲット遺伝子名、増幅サイズ
実験 1) pGKneo, 500 bp
実験 2) CAG promoter region + GFP, 3 kb

【プライマー配列】
実験 1) forward, reverse共に20 mer
実験 2) forward, 21 mer; reverse, 29 mer

【反応液組成】
●KOD FX
PCR grade water                   X μl
2x PCR buffer for KOD FX       7.5 μl
2mM dNTPs                           3 μl
10pmol /μl Primer #1             0.45 μl
10pmol /μl Primer #2             0.45 μl
KOD FX (1.0U/μl)                   0.3 μl 
サンプル            Y μl
-----------------------------------------------     
Total reaction volume            15 μl

※他社品は取説に従い調製を行いました。

【サイクル】
実験 1)
95℃ 2min.

(95℃ 30 sec., 56℃ 30 sec., 72℃ 30 sec.) 36 cycles

4 ℃, forever

実験 2)
95℃ 2 min.

(98℃ 10 sec., 60℃ 30 sec., 72℃ 3 min.) 33 cycles

4 ℃, forever

【データご提供】
高知大学医学部解剖学講座
三井 真一 先生

【先生からのコメント】
 想像以上に増幅効率が高く、驚きました。
 マウステールの処理ですが、以下のように行っています。3~5 mmの長さに切ったマウステールに500 μLのLysis buffer (100 mM Tris-Cl, pH8.5, 5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.2% SDS, 100μg/ml Proteinase K)を加えて56℃で一晩混合する。この溶解液の0.5 μLをテンプレートとして反応液に加えています。Proteinase Kの失活操作はしていません。overnightで処理しているうちに自己分解して失活するようです。経験上、加える液量が過剰であったり、テールの溶解時間が短い(数時間程度;テールは一応溶解しています)とバンドの出方が悪い気がしています。

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