KOD FX 実施例1
アルカリ溶解法で調製したマウステールライセートからの増幅

アルカリ溶解法(右の基本反応条件御参照)で調製したマウステールライセート0.5μlを直接PCR反応液に添加して、Mouse membrane glycoprotein(Thy-1)gene(M10246)をターゲットとして、2ステップサイクルを用いて、30サイクルの増幅を行いました。
その結果、KOD FXを用いた場合のみ、明瞭な増幅が認められました。アルカリ溶解法は、Proteinase Kを用いる方法よりも手間が少ないため、より簡便にトランスジェニックマウスの遺伝子解析ができるものと思われます。
また、増幅産物を精製なしで、数種類の制限酵素で消化する検討もあわせて行い、下記制限酵素により完全に切断を受けることを確認しました。




【マウステール前処理方法】
 

 <ご注意>
 1. 熱アルカリ溶液の取扱には十分ご注意ください。
 2. Proteinase Kを用いて調製されたライセートを直接
 PCRに用いることはお勧めできません。
 Proteinase KとSDSがPCR反応に悪影響を及ぼす恐れが
 あります。
 ご使用の場合、精製が必要となりますのでご注意くだ
 さい。
 

【PCR条件】

 テンプレート: 上記方法にて調製したLysateを水にて10倍希釈したサンプル 
                 0.5 μl / 50 μl Reaction
 ターゲット:   Mouse membrane glycoprotein (Thy-1) gene 2.6kb <M10246>
 プライマーシーケンス: 
       Primer#1 :5’-CCACAGAATCCAAGTCGGAACTCTTG-3’
       Primer#2 :5’-GTAGCAGTGGTGGTATTATACATGGTG-3’ 

  <反応条件>
                                 終濃度
 2x PCR buffer             25 μl       1×
 2mM dNTPs               10 μl       0.4mM each
 10pmol /μl Primer #1  1.5 μl       0.3μM
 10pmol /μl Primer #2  1.5 μl       0.3μM
 Mouse Tail Lysate        0.5 μl  
 KOD FX (1.0U/μl)         1 μl      1.0 U / 50μl
 PCR grade water          10.5μl
 -----------------------------------------------------------
 Total reaction volume    50 μl 

 <PCR サイクル条件>
                  94℃ 2min.
                  (98℃ 10sec,68℃ 2.5min.)×30cycles

他社製品のPCR条件は各社で推奨されているサイクルで増幅いたしました。


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